CENTRO  UNIVERSITÁRIO  UNIVATES   PROGRAMA  DE  PÓS-­GRADUAÇÃO      EM  BIOTECNOLOGIA                                         AÇÃO  ANTIMICROBIANA  DE  Rosmarinus  officinalis  E  Zingiber   officinale  FRENTE  A  Escherichia  coli  E  Staphylococcus  aureus  EM   CARNE  MECANICAMENTE  SEPARADA  DE  FRANGO       Andréa  Wolf  Diemer                                           Lajeado,  fevereiro  de  2016           Andréa  Wolf  Diemer                                       AÇÃO  ANTIMICROBIANA  DE  Rosmarinus  officinalis  E  Zingiber   officinale  FRENTE  A  Escherichia  coli  E  Staphylococcus  aureus  EM   CARNE  MECANICAMENTE  SEPARADA  DE  FRANGO                   Dissertação   apresentada   ao   Programa   de   Pós-­Graduação   em   Biotecnologia,   do   Centro   Universitário   UNIVATES,   como   parte  da  exigência  para  a  obtenção  do  grau   de  Mestre  em  Biotecnologia.     Orientador:  Prof.  Dr  Eduardo  M.  Ethur                   Lajeado,  fevereiro  de  2016           RESUMO   A   indústria   de   produtos   cárneos,   necessita   produtos   que   possuem   uma   demanda   alta   de   vendas,   porém,   o   consumidor,   em  busca   de   uma   vida  mais   saudável   está   exigindo   produtos   com   praticidade,   qualidade,   segurança   e   que   estes   sejam   nutritivos.  Um  dos   ingredientes  utilizados  para  a   fabricação  de  produtos  a  base  de   carne   é   o   nitrito.   Este   melhora   a   coloração,   realça   o   sabor,   impede   a   oxidação   lipídica   e   é   um   importante   agente   bactericida   na   indústria   de   alimentos.   Porém,   o   nitrito,   em   concentrações   elevadas   pode   ser   carcinogênico.   Levando   isto   em   consideração   o   objetivo   deste   trabalho   é   avaliar  a  ação   antimicrobiana   de   extrato   aquoso   e   óleo   essencial   de   alecrim   (Rosmarinus   officinalis)   e   gengibre   (Zingiber   officinale)   frente   a   Escherichia   coli   e   Staphylococcus   aureus   em   carne   mecanicamente   separada  de   frango   (CMS).Realizou-­se   as   análise   da  CIM  e  CBM   sendo  que  para  E.  coli  utilizando  o  extrato  aquoso  de  alecrim  verificou-­se,  uma  CIM   de  5,0  mg/mL  e  CBM  >20  mg/mL,  enquanto  o  extrato  aquoso  de  gengibre  uma  CIM   de  20  mg/mL  e  CBM  >20  mg/mL.  Para  o  óleo  essencial  de  alecrim  constatou-­se  uma   CIM  de  1,25  mg/mL  e  CBM  de  2,5  mg/mL,  enquanto  o  óleo  de  gengibre  uma  CIM  de   1,25  mg/mL   e  CBM   de   5,0  mg/mL.   Para  S.   aureus   utilizando   o   extrato   aquoso   de   alecrim,   obteve-­se   uma  CIM  e  CBM  de  5,0  mg/mL,   enquanto   o   extrato   aquoso  de   gengibre  uma  CIM  e  CBM  de  20  mg/mL.  Para  o  óleo  essencial  de  alecrim  constatou-­ se  uma  CIM  de  0,625  mg/mL  e  CBM  de  1,25  mg/mL,  enquanto  o  óleo  de  gengibre   uma  CIM  de  1,25  mg/mL  e  CBM  de  2,5  mg/mL.  A  partir  destes  resultados  pode-­se   dizer  que  os  mesmos  demonstram-­se  promissores  em  relação  a  ação  bactericida  e   bacteriostática.  Em  posse   dos   resultados   da  CIM  e  CBM,   descartou-­se   o   uso   dos   extratos   aquosos,   em   função   da   baixa   atividade   detectada   na   CIM   e   CBM,   então   seguiu-­se  os  experimentos  somente  com  os  óleos  essenciais,  em  seguida,  realizou-­ se  as  análises  de  contagem  de  colônias   (UFC)  das  amostras.  Para  estas  análises   verificou-­se   que   o   óleo   de   alecrim   e   gengibre   frente   as   bactérias  Escherichia   coli   (ATCC   25922)   e  Staphylococcus   aureus   (ATCC   6538P),   não   apresentaram   efeito   bacteriostático  e  nem  bactericida.  Diante  de  todos  os  resultados  constatou-­se  que  a   CIM  e  CBM  não  podem  ser  utilizados  como  parâmetro  microbiológico  para  matrizes   cárneas,   pois   o   comportamento   bactericida   e   bacteriostáticos   não   se   equivaleram,   isso  para  as  condições  dos  experimentos  realizados  nesta  pesquisa.   Palavras   chaves:   Microrganismos   patogênicos.   Intoxicação   alimentar.   Atividade   antimicrobiana.  Alecrim.  Gengibre           ABSTRACT   The  industry  of  meat  products,  you  need  products  that  have  a  high  demand  for  sales,   however,   consumers   in   search   of   a   healthier   life   is   demanding   products   with   convenience,  quality,  safety  and  they  are  nutritious.  One  of  the  ingredients  used  for   the  manufacture  of  meat  products  is  nitrite.  This  improves  the  color,  enhance  flavor,   prevent   lipid   oxidation   and   is   an   important   bactericidal   agent   in   the   food   industry.   However,   the   nitrite   in   high   concentrations   may   be   carcinogenic.   Taking   this   into   account  the  objective  of  this  study  is  to  evaluate  the  antimicrobial  activity  of  aqueous   extract   and   essential   oil   of   rosemary   (Rosmarinus   officinalis)   and   ginger   (Zingiber   officinale)   against   Escherichia   coli   and   Staphylococcus   aureus   in   mechanically   deboned  chicken  meat  (CMS).  It  was  performed  the  analysis  of  MIC  and  MBC  where   in  E.  coli  using  the  aqueous  extract  of  rosemary  was  found  a  MIC  of  5.0  mg/mL  and   MBC>  20  mg/mL,  while  the  aqueous  extract  of  ginger  a  20  MIC  mg/mL  and  MBC>  20   mg/mL.  For  rosemary  essential  oil  found  to  be  a  MIC  of  1.25  mg/mL  and  MBC  of  2.5   mg/mL,  where  as   the  MIC  one  ginger  oil  1.25  mg/mL  and  CBM  5.0  mg/mL.  For  S.   aureus   using   the   aqueous   extract   of   rosemary,   obtained   an  MIC   and  MBC   of   5.0   mg/mL   while   the   aqueous   extract   of   ginger   one   MIC   and   MBC   20   mg/mL.   For   rosemary  essential  oil   found  to  be  a  MIC  of  0.625  mg/mL  and  MBC  of  1.25  mg/mL,   where  as   the  MIC  one  ginger  oil   1.25  mg/mL  and  MBC  of  2.5  mg/mL.  From   these   results   it   can   be   said   that   they   show   promise   in   relation   to   bactericidal   and   bacteriostatic   action.   In   possession  of   the   results   of  MIC  and  MBC,  was  discarded   the  use  of  aqueous  extracts,  due  to  the  low  activity  detected  in  MIC  and  MBC,  then   the   experiments   followed   only   with   essential   oils,   then   was   held   the   analyzes   of   colony  counts  (CFU)  of  the  samples.  For  this  analysis  it  was  found  that  rosemary  oil   and  ginger  front  bacteria  Escherichia  coli  (ATCC  25922)  and  Staphylococcus  aureus   (ATCC   6538P),   and   showed   no   bacteriostatic   or   bactericidal   effect.   Before   all   the   results   it   was   found   that   the   MIC   and   MBC   can   not   be   used   as   microbiological   parameter  to  cárneas  arrays,  because  the  bactericidal  and  bacteriostatic  behavior  is   not  equaled,  that  for  the  conditions  of  the  experiments  in  this  study.   Key   words:   pathogenic   microorganisms.   Food   poisoning.   Antimicrobian   activity.   Rosemary.  Ginger           LISTA  DE  ILUSTRAÇÕES     LISTA  DE  FIGURAS   Figura  1  –  Estrutura  foliar  da  planta  do  alecrim  ........................................................  20   Figura  2  -­  Planta  e  rizoma  do  gengibre  (Zingiber  officinale)  .....................................  21   Figura  3  -­  Estrutura  química  do  1,8  Cineol  ................................................................  24   Figura  4  -­  Estrutura  química  da  cânfora  ....................................................................  25   Figura  5  -­  Estrutura  química  do  borneol  ....................................................................  25   Figura  6  -­  Estrutura  química  do  Alfa-­terpineol  ...........................................................  26   Figura  7  -­  Estrutura  química  do  β-­felandreno  ............................................................  26   Figura  8  -­  Estrutura  química  do  geranial  e  do  neral  ..................................................  27   Figura  9  -­  Estrutura  química  do  α-­zingibereno  ..........................................................  28   Figura  10  -­  Estrutura  química  do  γ-­curcumeno  .........................................................  28   Figura  12  -­  Estrutura  química  do  β-­bisaboleno  .........................................................  29   Figura  13  -­  Carne  mecanicamente  separada  (CMS)  de  frango  ................................  31   Figura  14  -­  Aparelho  de  extração  Clevenger  modificado  ..........................................  39   Figura  15  -­  Placa  de  96  poços  para  a  confirmação  da  CIM  ......................................  44   Figura  16  -­  Placa  de  Petri  com  Muller  Hinton  para  confirmação  da  CBM  .................  45   Figura  17  -­  Cromatograma  do  óleo  essencial  de  alecrim  ..........................................  49   Figura  18  -­  Cromatograma  do  óleo  essencial  de  gengibre  .......................................  51                     LISTA  DE  TABELAS   Tabela  1  -­  Rendimento  do  óleo  essencial  e  do  extrato  aquoso  de  alecrim  e  gengibre ...................................................................................................................................  48   Tabela  2  -­  Componentes  do  óleo  essencial  de  alecrim  ............................................  50   Tabela  3  -­  Componentes  do  óleo  de  gengibre  ..........................................................  52   Tabela   4   -­   Resultados   da   Concentração   Inibitória   Mínima   (CIM)   e   Concentração   Bactericida  Mínima  (CBM)  frente  a  E.  coli  do  alecrim  e  do  gengibre  ........................  53   Tabela   5   -­   Resultados   da   Concentração   Inibitória   Mínima   (CIM)   e   Concentração   Bactericida  Mínima  (CBM)  frente  Staphylococcus  aureus  do  alecrim  e  do  gengibre  54   Tabela   6   -­   Resultados   das   análises   de   contagem   microbiana   do   óleo   de   alecrim   frente  a  E.coli  em  (UFC)  ............................................................................................  57   Tabela   7   -­  Resultados   das   análises   de   contagem  microbiana   do   óleo   de   gengibre   frente  a  E.coli  em  (UFC)  ............................................................................................  57   Tabela   8   -­   Resultados   das   análises   de   contagem   microbiana   do   óleo   de   alecrim   frente  ao  S.  aureus  em  (UFC)  ...................................................................................  58   Tabela   9   -­  Resultados   das   análises   de   contagem  microbiana   do   óleo   de   gengibre   frente  ao  S.  aureus  em  (UFC)  ...................................................................................  58               LISTA  DE  ABREVIATURAS   ANVISA   Agência  Nacional  de  Vigilância  Sanitária   ATP     Adenosina  trifosfato   ATCC     American  Type  Culture  Collection   CLSI     Clinical  and  Laboratory  Standards  Institute     CBM     Concentração  Bactericida  Mínima   CG-­EM   Cromatografia  gasosa  acoplada  a  espectrometria  de  massas     CIM     Concentração  Inibitória  Mínima   CMS     Carne  Mecanicamente  Separada   CTPPA     Centro  Tecnológico  de  Pesquisa  e  Produção  de  Alimentos     DMSO     Dimetilsulfóxido   DV     Destilação  a  vapor   EUA     Estados  Unidos  da  América   FAO       Food  Agricultural  Organization   FIOCRUZ   Fundação  Oswaldo  Cruz   HD     Hidrodestilação   IK       Índice  de  retenção  de  Kovats       NCCLS   National  Committee  on  Clinical  Laboratory  Standards   OMS     Organização  Mundial  da  Saúde   pH     Potencial  hidrogeniônico   RDC     Resolução  da  Diretoria  Colegiada   RS     Rio  Grande  do  Sul   SFE     Extração  com  Fluído  Supercrítico   SIF     Serviço  de  Inspeção  Federal     TTC     Cloreto  de  trifeniltetrazólio     UFC     Unidades  Formadoras  de  Colônia   UFSM     Universidade  Federal  de  Santa  Maria     UV-­VIS   Ultra  Violeta-­  Visível   VRBA     Ágar  bile  vermelho  violeta   WHO     World  Health  Organization             SUMÁRIO   1   INTRODUÇÃO  .....................................................................................................  13   1.1   Objetivos  .....................................................................................................  17   1.1.1   Objetivo  geral  ............................................................................................  17   1.1.2   Objetivos  específicos  ...............................................................................  17   2   REFERENCIAL  TEÓRICO  ..................................................................................  18   2.1   Extratos  vegetais  .......................................................................................  18   2.1.1   Plantas  condimentares  .............................................................................  19   2.1.2   Alecrim  .......................................................................................................  19   2.1.3   Gengibre  ....................................................................................................  21   2.1.4   Metabolismo  vegetal  .................................................................................  22   2.2   Principais  componentes  dos  óleos  de  alecrim  e  gengibre  ....................  24   2.2.1   1,8  Cineol  ...................................................................................................  24   2.2.2   Cânfora  .......................................................................................................  24   2.2.3   Borneol  .......................................................................................................  25   2.2.4   α-­terpineol  .................................................................................................  26   2.2.5   β-­felandreno  ..............................................................................................  26   2.2.6   Neral  e  Geranial  .........................................................................................  27   2.2.7   γ-­curcumeno  e  α-­zingibereno  ..................................................................  27   2.2.8   β  -­bisaboleno  .............................................................................................  29   2.3   Utilização  do  óleo  essencial  pela  indústria  .............................................  29   2.4   Carne  Mecanicamente  Separada  (CMS)  ...................................................  30   2.5   Segurança  alimentar  e  Contaminação  .....................................................  33   2.6   Microrganismos  patogênicos  ...................................................................  34   2.6.1   Escherichia  coli  e  sua  contaminação  .....................................................  35   2.6.2   Staphylococcus  aureus  e  sua  Contaminação  ........................................  36   3   METODOLOGIA  ..................................................................................................  38   3.1   Amostras  .....................................................................................................  38   3.2   Obtenção  dos  extratos  ..............................................................................  39   3.2.1   Óleo  essencial  ...........................................................................................  39   3.2.2   Extrato  aquoso  ..........................................................................................  40   3.3   Processos  de  purificação  e  identificação  ................................................  40   3.3.1   Análise  da  composição  química  do  óleo  essencial  ..............................  40   3.3.2   Cromatografia  gasosa  e  o  Índice  de  Kovats  ..........................................  40     3.4   Aspectos  químicos  e  biológicos  ..............................................................  41   3.4.1   Atividade  antimicrobiana  .........................................................................  41   3.4.2   Análises   de   contagem  bacteriana   da   carne  mecanicamente   separada   (CMS)  contaminada  adicionada  de  óleo  essencial  ..............................................  45   4   RESULTADOS  E  DISCUSSÕES  ........................................................................  48   4.1   Rendimento  dos  extratos  ..........................................................................  48   4.2   Análise  cromatográfica  dos  óleos  essenciais  de  alecrim  e  gengibre  ..  49   4.3   Atividade  antimicrobiana  ...........................................................................  53   4.4   Resultados   das   análises   de   contagem   bacteriana   da   carne   mecanicamente  separada  (CMS)  contaminada  adicionada  de  óleo  essencial  .  55   5   CONCLUSÃO  ......................................................................................................  59   REFERÊNCIAS  .........................................................................................................  61     13   1   INTRODUÇÃO   As   indústrias   de   alimentos,   nas   últimas   décadas,   estão   enfrentando   um   grande   desafio   para   atender   as   exigências   legais   para   garantir   a   segurança   alimentar,   como   também   corresponder   as   expectativas   dos   consumidores   em   relação   a   preocupação   com   a   saúde,   pois   muitos   são   conscientes   dos   possíveis   efeitos   dos   aditivos   sintéticos   usados   na   conservação   dos   alimentos   (MACHADO;;   BORGES;;  BRUNO,  2011).  Aliados  aos  conceitos  de  produto  natural  e  asséptico  tem   aumentado   rapidamente.   Estes   produtos   podem   conter   ingredientes   naturais,   sem   conservantes   artificiais,   com   isso   não   desencadeando   alergias   ou   sensibilidades   comuns   que   podem  ocorrer   em  alguns   consumidores   em   função   do   acréscimo  de   aditivos  químicos  artificiais  na  formulação  de  alimentos,  principalmente  de  produtos   cárneos  (MARIUTTI;;  NOGUEIRA;;  BRAGAGNOLO,  2011).   Estima-­se  que  a  cada  ano  76  milhões  de  casos  de  doenças  transmitidas  por   alimentos   ocorram  apenas   nos  Estados  Unidos,   com  325.000   internações   e   5.000   óbitos,   levando  a  custos  médicos  e  prejuízos  envolvendo  a  produtividade,  na   faixa   de  US$  6,6  a  37,1  bilhões   (JAYASENA  e  JO,  2013).  No  que  se   refere  a  carnes  e   seus   derivados,   vários   microrganismos   patogênicos   incluindo   Salmonella   spp.,   Campylobacter  jejuni,  Escherichia  coli  O157:H7,  Listeria  monocytogenes,  Clostridium   spp.  e  Aeromonas  hydrophila  podem  resultar  em  doenças  transmitidas  por  alimentos   quando   estes   não   são   tratados   e   conservados   adequadamente.   As   células   vegetativas  dos  microrganismos  são  destruídas  com  o  tratamento  térmico,  mas  seus   esporos   permanecem,   tais   como   Bacillus   spp.   e   Clostridium   spp.   Eles   podem   sobreviver  e  precisam  de  condições  muito  mais  severas  para  ser  destruídos.  Com  a   ausência   de  microbiota   competitiva,   estes   esporos   podem   germinar   e   crescer   em     14   condições  favoráveis  causados  pela  utilização  indevida  dos  produtos  (JAYASENA  e   JO,  2013).   As   carnes   e   seus   derivados   são   altamente   propensos   a   contaminação   microbiana,   uma   vez   que   eles   são   ricos   em   nutrientes   essenciais   e   perecíveis   na   natureza,   sendo   que   esta   contaminação   pode   ser   mais   acelerada   em   função   de   alguns   fatores   intrínsecos   incluindo   pH   e   atividade   de   água   da   carne   fresca.   Normalmente,  a  carne  fresca  tem  um  valor  de  atividade  de  água  maior  do  que  0,85  e   seu   pH   está   na   faixa   do   pH   favorável   para   as   bactérias   deteriorantes   da   carne   (DAVE  e  GHALY,  2011).     Em   função   do   dinamismo   diário   das   pessoas,   estas   estão   direcionando   e   realizando  mudanças  nos  padrões  nutricionais.  Procurando  benefícios  creditados  a   uma  alimentação  saudável  em  todos  os  setores  da  alimentação,  com  isso,  levando  à   busca   por   alternativas   de   transformação,   conservação   e   alteração   química   destes   produtos.  Os  objetivos  da  indústria  alimentícia  consistem  basicamente  em  prolongar   o   período   durante   o   qual   o   alimento   permanece   adequado   para   o   consumo,   aumentar   a   variedade   da   dieta,   fornecer   os   nutrientes   necessários   para   a   manutenção  da  saúde  e  gerar  lucros  para  os  fabricantes.   Alguns  microrganismos,  quando  encontrados  em  alimentos  são  chamados  de   indicadores,   pois   estes   apontam   a   falta   de   cuidados   no   processamento   dos   alimentos,   um   deles   e   a  Escherichia   coli  que   é   um  microrganismo   que   coloniza   o   intestino   de   humanos   e   animais   de   sangue   quente.   Essa   bactéria   quando   encontrada   em   alimentos   ou   águas,   indica   uma   má   qualidade   sanitária,   essa   contaminação  pode  vir  da  falta  de  higiene  do  manipulador  ou  até  mesmo  durante  a   evisceração  no  abate  (SKOČKOVÁ  et  al.,  2015),  e  outro  pode  ser  o  Staphylococcus   aureus,  é  um  contaminantes  de  produtos   lácteos,  carnes   (principalmente  de  aves),   ovos,   atum,  macarrão  e  outros,  muitas   vezes,   são  produtos  que  necessitam  muita   manipulação   no   preparo,   em   função   disso   deve-­se   ter   cuidado   ao   manipular   os   alimentos  isso  pelo  fato  de  que  o  S.  aureus  é  um  microrganismo  que  está  presente   na  pele  (CARMO  et  al.,  2002).     O  uso  de  aditivos  alimentares  no  Brasil  é  norteado  pelo  Ministério  da  Saúde  e   regulamentado   pela   Agência   Nacional   de   Vigilância   Sanitária   (ANVISA),     15   considerando   aditivo   alimentar   qualquer   ingrediente   adicionado   intencionalmente   aos   alimentos,   sem   propósito   de   nutrir,   porém,   com   o   objetivo   de   modificar   as   características   físicas,   químicas,   biológicas   ou   sensoriais,   durante   a   fabricação,   processamento,   preparação,   tratamento,   embalagem,   acondicionamento,   armazenagem,   transporte   ou   manipulação   de   um   alimento,   de   acordo   com   as   diretrizes   preconizadas   pela   Portaria   nº   540/97.   Segundo   esta  mesma  Portaria   os   aditivos  químicos  são  classificados  quanto  à   função:  os  agentes  conservantes  são   substâncias   que   têm   a   finalidade   de   impossibilitar   ou   atrasar   a   deterioração   microbiana  ou  enzimática  dos  alimentos  (BRASIL,  1997).   Uma   opção   para   o   controle   da   contaminação   microbiana   são   os   antimicrobianos  de  origem  vegetal,  sendo  que  estes  podem  ser  obtidos  através  de   vários   métodos   como   extração   aquosa,   infusões   e   decocções   por   solventes   orgânicos   entre   outras,   sendo   que   estas   extrações   são   geralmente   realizadas   utilizando   qualquer   parte   das   plantas,   sendo   que   muito   possuem   efeito   antimicrobiano,   como   por   exemplo   componentes   do   orégano,   cravo,   canela,   alho,   coentro,   alecrim,   salsa,   erva-­cidreira,   sálvia   e   vanilina   (TAJKARIMI;;   IBRAHIM;;   CLIVER,  2010). Diante   disso,   estuda-­se   novos   compostos   que   possam   auxiliar   na   correta   substituição  dos  conservantes,  frequentemente  utilizados  no  controle  do  crescimento   de   microrganismos,   e   que   sejam   confiáveis   o   suficiente   para   a   inclusão   em   um   sistema   de   conservação   de   alimentos.   Levando   em   consideração   este   contexto,   óleos   essenciais   de   plantas   condimentares   já   utilizados   como   flavorizantes   e   com   alto   potencial   antimicrobiano   ganham   uma   nova   perspectiva   de   utilização   (MACHADO;;  BORGES;;  BRUNO,  2011).   O  aumento  da  demanda  por  alimentos  seguros  e  naturais,  sem  conservantes   químicos,   incentiva   os   pesquisadores   a   estudar   a   atividade   antimicrobiana   de   compostos   naturais.   Investigações   confirmaram   a   ação   antimicrobiana   dos   óleos   essenciais  (RASOOLI  et  al.,  2008).   A   busca   de   novos   antimicrobianos   a   partir   de   espécies   vegetais,   tem   se   mostrado  bastante  promissora  nos  últimos  tempos,  visando  sanar  os  problemas  da   resistência  microbiana  a  antibióticos  atualmente  utilizados  (HAIDA  et  al.,  2007).     16   A   segurança   alimentar   e   o   atendimento   às   demandas   para   conservação   e   qualidade   vem   alavancando   a   pesquisa   para   o   desenvolvimento   de   métodos   alternativos   na   conservação   de   alimentos.   Essas   crescentes   demandas   abrem   novas  perspectivas  para  o  uso  de  conservantes  naturais,  dentre  eles,  os  derivados   de  plantas,  bem  como  os  condimentos  (TIWARI  et  al.,  2009).   Os  condimentos  originalmente  utilizados  para  alterar  ou  melhorar  o  sabor  dos   alimentos,  as  ervas  e  especiarias  possuem  metabólitos  secundários,  como  os  óleos   essenciais,  que  desempenham  papel  protetor  de  plantas  contra  agentes  infecciosos   como   bactérias   (BAKKALIL   et   al.,   2008),   sendo   consideradas   importantes   substâncias   bioativas,   podendo   serem  utilizadas   para   a   conservação   de   alimentos   (SHAO;;  ZHOU;;  TSAO,  2011).   O  alecrim  (Rosmarinus  officinalis),  pertencente  à  família  Lamiaceae,  originária   de  países  do  mediterrâneo,  sendo  que  no  Brasil  também  é  cultivada.  Além  das  suas   propriedades   medicinais   conhecidas   a   atividade   antimicrobiana   é   muito   relatada.   Estudos   já   realizados   identificaram   33   compostos   químicos   no   óleo   essencial   de   alecrim.   Os   principais   foram   α-­pineno,   1,8-­cineol,   cânfora,   verbenona   e   borneol,   constituindo  cerca  de  80%  do  total  do  óleo  (SANTOYO,  2005).   Segundo  Singh  (2008),  o  gengibre  é  uma  das  ervas  mais  antigas  conhecidas   pelo   povo,   utilizado   na   culinária   e   na   medicina   e   também   conhecido   pelas   suas   características  como  antioxidante  e  antibacteriana.   Considerando   que   muitos   condimentos   possuem   características   antibacterianas  descritas  na  literatura,  escolheu-­se  Gengibre  (Z.  officinale)  e  Alecrim   (R.   officinalis) para   testar   estas   características   em   carne   mecanicamente   separa   (CMS)  contaminada.  Diante  disso  esta  pesquisa  tem  por  objetivo  realizar  um  estudo   em   relação   à   ação   antimicrobiana   e   sua   aplicação   em   um   produto   cárneo   (CMS)   analisando  seus  efeitos  como  conservante  natural.     17   1.1   Objetivos   1.1.1   Objetivo  geral   Avaliar  a  atividade  antimicrobiana  de  alecrim  e  gengibre,  óleos  essenciais  e   extratos  aquosos,  frente  à  Escherichia  coli  (ATCC  25922)  e  Staphylococcus  aureus   (ATCC  6538P).   1.1.2   Objetivos  específicos   •   Determinar   a   composição   química   dos   óleos   essenciais   de   alecrim   e   gengibre.     •   Avaliar   o   extrato   e   óleo   essencial   dos   diferentes   condimentos   quanto   à   atividade   antimicrobiana   em   (CIM)   Concentração  Mínima   Inibitória   e   (CBM)   Concentração  Bactericida  Mínima;;   •   Avaliar   a   capacidade   antimicrobiana   do   extrato   e   óleo   essencial   quando   adicionados  em  carne  mecanicamente  separada  de  frango  contaminada.         18   2   REFERENCIAL  TEÓRICO   2.1   Extratos  vegetais  e  óleo  essencial   Extratos  brutos   são  aqueles  onde   todas  as  moléculas   são  extraídas  na   sua   totalidade,   sem   que   alguma   seja   isolada   especificamente.   As   plantas   produzem   diferentes  metabólitos  secundários  com   funções  variadas  entre  eles,  defesa  contra   pragas  e  doenças,  faz  com  que  estas  plantas  possuam  vários  princípios  ativos  nos   extratos  vegetais  (NELSON  e  COX,  2011).  Segundo  PERES  (2007),  a  presença  de   vários   compostos   em   um   só   produto   pode   ter   efeito   sinérgico   benéfico,   o   que   confere  aos  extratos  vegetais  certa  vantagem  sobre  os  antimicrobianos  tradicionais   que  possuem  apenas  um  princípio  ativo.   Os  óleos  essenciais,  possuem  várias  características  sendo  uma  delas  a  ação   na  atividade  antimicrobiana,  esta  ação  ocorre  devido  a  sua  elevada  hidrofobicidade,   que   permite   atravessar   as   membranas   bacterianas,   provocando   a   perda   de   íons,   reduzindo  assim  o  potencial  de  proteção  da  membrana,  ocorre  também  a  perda  da   função   das   bombas   de   prótons   e   depleção   de   ATP   (Adenosina   trifosfato),   ou   até   mesmo  danos  a  proteínas,  lipídios  e  organelas  presentes  dentro  da  célula  bacteriana   acarretando  assim  morte  celular  (PESAVENTO  et  al.,  2015;;  BAKKALI  et  al.,  2008).   Óleos   essenciais,   são   obtidos   de   diversas   partes   de   plantas,   como   frutas,   flores,  cascas,  ou  de  plantas   inteiras,  como  especiarias,  ervas  medicinais  e  outras,   sendo  que  estes  podem  ser  designados  como  óleos  etéreos,  voláteis  ou  até  mesmo   como   essências,   chamados   assim   em   função   das   suas   características   físico-­ químicas,   como   ser   normalmente   líquidos   de   aparência   oleosa   a   temperatura     19   ambiente.   A   volatilidade   é   uma   das   mais   importantes   características,   pois   esta   o   diferencia  dos  óleos  fixos,  que  são  misturas  de  substâncias  lipídicas  (SIMÕES,  et  al.,   2004).   De   acordo   com   a   Resolução   da   Diretoria   Colegiada   (RDC)   nº   2,   de   15   de   janeiro  de  2007,  óleos  essenciais  são  produtos  voláteis  de  origem  vegetal  obtido  por   processo   físico   (destilação   por   arraste   com   vapor   de   água,   destilação   a   pressão   reduzida   ou   outro   método   adequado).   Podem   se   apresentar   isoladamente   ou   misturados  entre  si,  retificados,  desterpenados  ou  concentrados.  Retificados  são  os   produtos  que  tenham  sido  submetidos  a  um  processo  de  destilação  fracionada  para   concentrar   determinados   componentes;;   concentrados   são   os   que   tenham   sido   parcialmente  desterpenados;;  e  desterpenados,  aqueles  dos  quais   tenha  sido  tirada   quase  totalmente  os  terpenos  (BRASIL,  2007).   Os   óleos   essenciais   no   meio   ambiente,   possuem   um   papel   importante   na   proteção   das   plantas   como   agentes   antibacterianos,   antivirais,   antifúngicos,   inseticidas  e  também  contra  herbívoros,  reduzindo  seu  interesse  por  essas  plantas.   Outra   característica   interessante   é   a   capacidade   de   atrair   alguns   insetos   para   favorecer  a  dispersão  de  pólen  e  sementes,  ou  de  repelir  outros  indesejáveis  (CALO   et.al.,  2015).   2.1.1   Plantas  condimentares   Plantas   condimentares   são   plantas   que   possuem   características   organolépticas   que   conferem   um   diferencial   principalmente   aos   alimentos,   como   gosto   requintado   e   aroma   diferenciado,   embelezando   os   pratos   e   tornando-­os   apetitosos   e   nutritivos,   além   dessas   propriedades   atuam   como   antissépticos,   antioxidantes,  antimicrobianos,  antinflamatórios  entre  outros  (MATOS,  2007).   2.1.2   Alecrim   O  alecrim  (Rosmarinus  officinalis  L.),  pertence  a  família  Lamiaceae-­Labiatae,   originária  do  Sul  da  Europa  e  do  Norte  da  África,   tem  como  características  ser  um   subarbusto   com   ramificações   de   cor   verde,   possui   hastes   lenhosas   e   folhas   pequenas   (Figura   1),   sendo   que   a   composição   química   do   seu   óleo   é   constituído     20   principalmente   por   hidrocarbonetos   monoterpênicos,   ésteres   terpênicos,   linalol,   verbinol,   terpineol,   3-­octanona   e   acetato   de   isobornila.   Os   terpenóides   são   representados   pelo   carnosol,   ácidos   carnosílico,   oleânico,   ursólico,   diterpenos   tricíclicos  (SILVA  et  al.,  2008).   As  pesquisas  em  relação  ao  óleo  do  alecrim  estão  focadas  principalmente  em   relação  a  sua  capacidade  antibacteriana,  antifúngica,  inseticida,  anticarcinogênica  e   antioxidante   (JÓRDAN   et   al.,   2013).   Este   óleo   essencial   pode   ser   classificado   de   três   formas   em   relação   a   sua   composição   química,   cineoliferum   (alto   teor   de   1,8-­ cineol,   53-­67%);;   camphoriferum   (cânfora   >20%);;   e   verbenoniferum   (verbenona   >15%)   (NAPOLI   et   al.,   2010).   Segundo  Rozman   e   Jersèk   (2009),  R.   officinalis   L.,   que   é   uma   planta   aromática   e   medicinal,   possui   o   óleo  mais   utilizado   em   todo   o   mundo  em  função  de  suas  propriedades  biológicas.   Figura  1  –  Estrutura  foliar  da  planta  do  alecrim     Fonte:  Google  imagens   Várias   pesquisas   vem   demonstrando   a   atividade   do   óleo   do   alecrim   contra   vários  microrganismos  patogênicos  tanto  para  bactérias  Gram-­positivas  quanto  para   as  Gram-­negativas  (BARRETO,  2014).  Diante  dos  resultados  obtidos  nas  pesquisas   tem   sido   sugerido   que   em   função   dos   óleos   essenciais   possuírem   compostos   hidrofóbicos,  estes  são  capazes  de  romper  a  membrana  plasmática  das  células  de     21   bactérias   Gram-­negativas,   assim   ocorrendo   uma   alteração   na   permeabilidade   da   membrana  e  consequentemente  morte  celular  (HYLDGAARD  et  al.,  2012;;  WANG  et   al.,  2012).   2.1.3   Gengibre   Zingiber   officinale   foi   inicialmente   descrito,   em   1807,   pelo   botânico   William   Roscoe.  Pertence  à  família  Zingiberaceae,  proveniente  da  região  sudoeste  da  Ásia  e   do  Arquipélago  Malaio,  sendo  que  este  incluí  mais  de  1200  espécies  e  53  gêneros.   O   rizoma   possui   corpo   alongado,   um   pouco   achatado,   com   ramos   fragmentados   irregularmente,   de   3   a   16   cm   de   comprimento,   3   a   4   cm   de   largura   e   2   cm   de   espessura  (Figura  2).  Sua  coloração  varia  do  amarelo  ouro  a  marrom  brilhante  isso   externamente,  com  estrias   longitudinais  (ELPO,  2004),  algumas  vezes  fibroso,  com   terminações   conhecidas   como   “dedos”,   as   quais   surgem   obliquamente.   Na   parte   interna,   de   cor   marrom-­amarelada,   apresentando   uma   endoderme   amarela,   com   numerosos   feixes   fibrovasculares   e   abundantes   células   oleaginosas   contendo   oleoresina  e  1%  a  4%  de  óleo  essencial  (ZANCAN  et  al.,  2002).     Figura  2  -­  Planta  e  rizoma  do  gengibre  (Zingiber  officinale)     Fonte:  Google  imagens     22   Popularmente   conhecido   como   gengibre,   é   utilizado   como   condimento   na   culinária,   pois   este   confere   características   picantes   e   refrescantes   às   receitas.   Também   é   usado   como   planta   medicinal,   sendo   que   este   apresenta   várias   características,   tais   como:   antifúngica,   antiviral,   antibacteriana,   antiulcerativa,   antioxidante,  antitumoral  e  outras.  A  parte  da  planta  mais  conhecida  é  o   rizoma,  o   qual   é   rico   em   carboidratos,   lipídeos,   incluindo   ácidos   graxos   livres,   (ácido   oléico,   ácido   palmítico,   ácido   linoleico),   óleos   (gingerol   e   gingerona)   e   óleos   voláteis,   (gingibereno,  felandreno  e  canfeno)  (LÓPEZ,  2007).   2.1.4   Metabolismo  vegetal   O   metabolismo   vegetal   se   divide   em   2   partes   em   relação   a   produção   de   metabólitos,   um   é   o   primário   (macromoléculas)   e   o   outro   secundário   (micromoléculas).  O  metabolismo  primário  é  o  que  produz  as  substâncias  essenciais   para   a   manutenção   da   vida   da   célula,   sendo   que   este   compreende   a   síntese   de   aminoácidos   proteínas,   lipídios   e   outras  moléculas   responsáveis   pela  manutenção   das  reações  vitais  da  célula.  Os  metabólitos  primários  são  substâncias  químicas  que   através   de   rotas   biossintéticas   complexas,   e   muitas   vezes   desconhecidas,   dão   origem  aos  metabólitos  secundários  (FILHO  e  PICCOLI,  2010;;  SIMÕES  et  al.,  2004).   Os  metabólitos   secundários   resultam   da   exposição   e   interação   das   plantas   com  o  meio  ambiente,  produzindo  assim  substâncias  que  servem  para  sua  proteção.   Estes   são   normalmente   uma   estrutura   complexa,   demonstram   alta   atividade   biológica,   baixo   peso   molecular,   normalmente   encontrados   em   pequenas   concentrações   e   são   advindos   de   determinadas   espécies   de   plantas   (NELSON   e   COX,  2011).   Os   produtos   formados   no   metabolismo   secundário   podem   ser   subdivididos   em   três   grandes   partes:   compostos   fenólicos,   alcalóides   e   terpenóides.   Os   compostos   fenólicos   são   encontrados   geralmente   em   todo   reino   vegetal,   mas   às   vezes   podem   estar   localizados   em   uma   só   planta.   Este   grupo   pode-­se   dividir   em   flavonóides   (antocianinas,   flavonóis   e   seus   derivados)   e   ácidos   fenólicos   (ácidos   benzóico,   cinâmico   e   seus   derivados)   e   cumarinas.   Os   compostos   fenólicos   são   substâncias  que  possuem  em  sua  estrutura  química  pelo  menos  um  anel  aromático,   onde   pelo   menos   um   hidrogênio   é   substituído   por   um   grupamento   hidroxila,     23   derivados   dos   fenilpropanóides   da   via   do   ácido   chiquímico   (SIMÕES   et   al.,   2004;;   ROCHA,  2013).   Os   alcalóides   são   substâncias   naturais   de   baixo   peso  molecular,   tem   como   característica   a   presença   de   um   átomo   de   nitrogênio   em   sua   estrutura   básica.   Constituem  uma  classe  numerosa  que  é  dividida  em  subclasses  por  apresentar  vias   de   síntese   não   relacionadas   evolutivamente.   Um   exemplo   é   a   morfina   isolada   de   Papaver  somniferum  (papoula)  (WINK,  2003).   Os   terpenos   são   metabólitos   secundários   de   plantas.   Estes   podem   formar   classes   com   estruturas   e   funcionalidades   diferentes,   formadas   a   partir   de   cinco   unidades   carbono   (C5),   chamado   de   isopreno.   Eles   possuem   muitos   efeitos   benéficos   à   saúde,   como   ação   antiparasitária,   antinflamatória,   antialérgica   e   incluindo  a  ação  antimicrobiana  e  outras.  Os  principais  terpenos  são:  monoterpenos   (C10)   e   sesquiterpenos   (C15),   porém   também   existe   os   hemiterpenos   (C5),   diterpenos   (C20),   triterpenos   (C30)   e   tetraterpenos   (C40).   Os   monoterpenos   são   formados   a   partir   da   união   de   duas   unidades   de   isopreno   (C10).   Estas   são   as   moléculas   mais   representativas   que   constitui   90%   de   óleos   essenciais   e   permite   uma  grande  variedade  de  estruturas  (BAKKALI  et  al.,  2008).   Os  sesquiterpenos  são   formados  a  partir  da  montagem  de   três  unidades  de   isopreno   (C15).   A   extensão   da   cadeia   aumenta   o   número   de   cyclisations   que   permite   que   uma   grande   variedade   de   estruturas.   A   estrutura   e   função   dos   sesquiterpenes  são  semelhantes  às  dos  monoterpenos:  β-­bisabolene,  cadinenes,  β-­ cariofileno,   logifolene,   curcumenes,   elemenes,   farnesenes,   zingibereno,   bisabol,   cedrol,  β-­nerolidol,  farnesol,  carotol,  β-­santalol,  patchoulol,  viridiflorol,  germacrone,  β-­ vetinone,   turmerones,  óxido  de  cariofileno,  humuleno  epóxidos  e  outros.  Exemplos   de   plantas   contendo   estes   compostos   são:   bergamota,   cominho,   aipo,   citronela,   coentro,  eucalipto,  gerânio,  zimbro,   lavanda,   limão,  menta,   laranja,  hortelã-­pimenta,   alecrim,  sálvia,  tomilho  e  outros  (BAKKALI  et  al.,  2008).   Alguns   componentes   dos   óleos   essenciais   são   capazes   de   sensibilizar   a   membrana   celular,   com   isso   aumentando   a   permeabilidade   da   mesma,   assim   causando   um   vazamento   dos   componentes   intracelulares   vitais,   baixa   no   sistema     24   enzimático   e   respiração   celular,   por   fim   debilitando   ou   até   causando   a   morte   do   microrganismo  (CELIKEL;;  KAVAS,  2008).   2.2   Principais  componentes  dos  óleos  de  alecrim  e  gengibre     2.2.1   1,8  Cineol   É  um  monoterpeno,  também  conhecido  como  cajeputol,  1,8-­epoxi-­p-­mentano,   1,8-­óxido-­p-­mentano,  eucaliptol  entre  outros  (Figura  3).  Líquido  translúcido  podendo   ser  amarelado.  Pode  ser  encontrado  em  folhas  de  louro,  artemísia,  manjericão  doce,   absinto,  alecrim,  sálvia  comum  e  outras  folhagens  planta  aromática.  Este  composto   é  utilizado  como  aromatizante  em  vários  produtos,  incluindo  produtos  de  panificação,   confeitaria,  produtos  de  carne  e  bebidas  (SANTOS  e  RAO,  2000).   Segundo   Auricchio   e   Bacchi   (2003)   óleos   essenciais   contendo   citronelol,   geraniol,  cineol,  linalol  e  sesquiterpenos  são  os  compostos  que  demonstram  possuir   atividade  antimicrobiana.   Figura  3  -­  Estrutura  química  do  1,8  Cineol     Fonte:  Da  autora   2.2.2   Cânfora   A   cânfora   é   um   monoterpeno   bicíclico   cetônico,   com   fórmula   molecular   C10H16O   (Figura   4),   pode   ser   obtida   do   canforeiro   (Cinnamomum   canphora)   e   de   outras   plantas   aromáticas   como   em   algumas   árvores   da   família   do   louro,   nomeadamente   Ocotea   usambarensis.   Folhas   de   alecrim   secas   da   família   das   mentas,  podem  conter  até  20%  de  cânfora.  Industrialmente  pode  ser  obtida  a  partir   do  α-­pineno.   A   cânfora   tem   como   característica   sabor   amargo,   forte   odor   e   em   contato   com  a  pele   causa  uma  sensação  de   frio.  Seu  uso  vai   desde  o  uso  contra     25   gripes,   contra   histeria,   nervosismo,   neuralgia   e   diarreia   por   uso   interno,   e   externamente   empregada   contra   reumatismos,   bronquites   e   inflamações   até   ação   antibacteriana,  pois  esta  era  utilizada  antigamente  pelos  egípcios  para  mumificação,   com   finalidade   de   conservação   (ALSALME   et   al.   2010;;   KUMAR   e   ANDO,   2007;;   MOGRICH  et  al.,  2005;;  MARTIN  et  al.  2004).   Figura  4  -­  Estrutura  química  da  cânfora     Fonte:  Da  autora     2.2.3   Borneol   É   um   composto   orgânico   classificado   como   um   terpeno,   bicíclico,   pode   ser   encontrado  em  várias  plantas  aromáticas,  e  pode  ser  sintetizado  a  partir  da  redução   da  cânfora,  a  ação  do  borneol  (Figura  5)  pode  ir  desde  aplicações  medicinais  (TANG   et  al.,  2015),  em  cosméticos  como  sabonetes  perfumes  ou  até  mesmo  produtos  de   limpeza   (BHATIA;;   LETIZIA.;;   API,   2008),   até   ação   antibacteriana,   onde   Mourey   e   Canillac  (2002)  relatam  que  quando  utilizados  óleos  ricos  em  borneol  estes  exibiram   ótimo   desempenho   em   relação   a   capacidade   bactericida   o   que   comprova   o   já   conhecido  potencial  desta  substância.     Figura  5  -­  Estrutura  química  do  borneol     Fonte:  Da  autora     26   2.2.4   α-­terpineol     É  um  álcool  monoterpeno   (Figura   6),   de   odor   agradável,   volátil,   encontrado   naturalmente   no   óleo   de   cajepute,   óleo   de   pinheiro   e   óleo   de   petitgrain,   possui   grandes   propriedades   antifúngicas   e   antissépticas,   utilizado   como   aromatizante,   cosméticos   entre   outras.   Produzido   sinteticamente   através   dos   pinenos   ou   até   mesmo  da  terebintina  (CEBORSKA  et  al.,  2015).   Figura  6  -­  Estrutura  química  do  Alfa-­terpineol     Fonte:  Da  autora   2.2.5   β-­felandreno   β-­felandreno   (C10H16)   é   um   monoterpeno   (Figura   7)   que   possui   um   valor   comercial   como   ingrediente   essencial   na   formulação   de   remédios,   produtos   de   limpeza,  cosméticos,   inseticida  e   também  utilizado  como  combustível,  o  odor  de  β-­ felandreno   tem   sido   descrito   como   picante   e   ligeiramente   mentolado   e   cítrico   (BENTLEY  et  al.,  2013).   Figura  7  -­  Estrutura  química  do  β-­felandreno     Fonte:  Da  autora     27   2.2.6   Neral  e  Geranial   O  neral   é   um   isômero  do   citral,   onde  o  α-­citral   é   o  geranial   e   o  β-­citral   é   o   neral,  que  são  aldeídos  monoterpênicos  acíclicos  (Figura  8).  O  geranial  tem  um  odor   forte  de   limão.  O  neral   tem  um  odor  de   limão  menos   intenso,  porém  mais  doce.  O   citral   é,   portanto,   é   um   composto   aromático   usado   na   perfumaria   pelo   seu   efeito   cítrico,  cosméticos,  conservante  e  também  utilizado  na  síntese  de  vitamina  A.     O  citral   também  é  usado  na   indústria  alimentícia  e  para   fortalecer  o  óleo  de   limão.  Também  possui  forte  ação  anti-­microbiana,  e  efeitos  feromônicos  em  insetos   (XIANG,  2015).  O  citral  pode  ser  extraído  da  litsea  cubeba,  capim-­limão,  gengibre,  e   muitas   outras   plantas   por   possuírem   uma   quantidade   abundante   deste   composto   (HO  et   al.,   2010,  KIRAN  et   al.,   2013,  WILSON  et   al.,   2002   e  YANG  et   al.,   2013).   Segundo  Abe  et  al.  (2003)  o  geranial  mostrou-­se  eficaz  na  ação  antifúngica.   Figura  8  -­  Estrutura  química  do  geranial  e  do  neral     Fonte:  Da  autora     2.2.7   γ-­curcumeno  e  α-­zingibereno   São  hidrocarbonetos  sesquiterpenos  monocíclicos   (Figura  9  e  10),  possuem   ação  inseticida,  repelente,  sendo  que  estes  podem  ser  extraídos  a  partir  do  rizoma   de   gengibre.   Os   principais   constituintes   do   óleo   de   gengibre   segundo   Antonious   (2003),   foram   α-­zingibereno   (27-­30%),   α-­curcumeno   (8-­9%),   β-­sesquiphellandrene   (4,8%).   e   bisaboleno   (3,2%).   Sacchetti   (2004),   demonstrou   em   seus   experimentos   que  o  α-­zingibereno  possui  ação  bactericida.   O  gengibre  possui  sabor  pungente  do  gingerol  e  shagaol,   tendo  zingibereno   como   componente   predominante   de   óleos   (ANTONIOUS,   2003).   Nychas   e     28   Skandamis   (2003)   relatam   que   α-­pineno,   borneol,   canfeno   e   linalol   possuem   propriedades  antibacterianas.  Segundo   relatos  o  extratos  de  gengibre  possui   ação   para   inibir   o   crescimento   de   Listeria   monocytogenes,   Salmonella   typhimurium,   Staphylococcus   aureus,   Bacillus   cereus,   B.   subtilis,   E.   coli,   F.   moniliforme   e   Mycobacterium   sp..   Óleos   de   gengibre   mostraram-­se   muito   bons   em   relação   a   inibição  da  Salinococcus  roceus,  Holopogon  turkmenicus  e  Halococcus  morrhuae.     De   acordo   com   alguns   estudos   realizados   com   óleo   essencial   e   extrato   alcoólico   de   gengibre   frente   a   diversos   patógenos   alimentares   verificaram   ótima   atividade   antimicrobiana   (SA-­NGUANPUAG,   2011;;   YOUSUFIL,   2012;;   AHMED,   2012).   Provavelmente   estes   relatos   de   ação   bactericida   se   dá   em   função   do   α-­ zingibereno  e  do  curcumeno.   Figura  9  -­  Estrutura  química  do  α-­zingibereno     Fonte:  Da  autora   Figura  10  -­  Estrutura  química  do  γ-­curcumeno     Fonte:  Da  autora     29   2.2.8   β  -­bisaboleno   O  β-­bisaboleno  é  um  sesquiterpeno  (Figura  11),  encontrado  em  várias  plantas   como   orégano   e   gengibre,   tem   odor   balsâmico,   possui   ação   analgésica   e   anti-­ inflamatória  e  também  é  utilizado  como  aditivo  alimentar  (GARCIA  E  YAMAGUCHI,   2012).   Segundo   o   relato   de   Andrade   (2012)   a   composição   do   óleo   essencial   de  Zingiber   officinale,   como  sendo   os   compostos   majoritários   os   monoterpenos   oxigenados,   geranial   (25,06%),   neral   (16,47%),   1,8-­cineol   (10,98%),   geraniol   (8,51%)  e  acetato  de  geranila  (4,19%)  e  o  monoterpeno  bicíclico,  canfeno  (4,30%).   Figura  11  -­  Estrutura  química  do  β-­bisaboleno     Fonte:  Da  autora     2.3   Utilização  do  óleo  essencial  pela  indústria   No  processo  de  fabricação  de  derivados  cárneos,  como  salsicha,  mortadelas,   presuntos  e  bacon,  utiliza-­se  nitratos  e  nitritos  como  conservantes,  sendo  que  estes   são   adicionados   juntamente   com   os   sais   de   cura,   promovendo   a  formação   e   estabilidade  da  cor  dos  produtos  cárneos  e  atividade  antimicrobiana.  Os  nitratos  são   pouco  tóxicos  a  níveis  baixos,  porém,  os  nitritos  possuem  uma  toxicidade  maior,  pois   são   capazes   de   se   combinar   com   compostos   presentes   nos   alimentos,   formando   compostos  nitrosos  denominados  nitrosaminas.  Esses  compostos   tem-­se  mostrado   cada  vez  mais  com  ação  cancerígena  e  mutagênica.  A  sua   formação  e  ocorrência   estão  sendo  muito  estudadas  e  relatadas  com  o  intuito  de  se  conhecer  melhor  esse   tipo  de  contaminante  e  os  riscos  envolvidos  com  a  ingestão  destes  (ARAUJO  et  al.,   2008).   Levando   em   consideração   o   descrito,   uma   opção   de   remediação   ou     30   minimização   dos   efeitos   colaterais   do   nitrito   e   do   nitrato   pode   ser   o   emprego   de   princípios  ativos  de  condimentos  que  possuem  características  antimicrobianas.   Condimentos   e   óleos   essenciais   são   utilizados   pela   indústria   de   alimentos   como  agentes  naturais  para  estender  a  vida  útil  dos  alimentos.  Os  antimicrobianos   de   origem   vegetal   são   obtidos   através   de   vários  métodos   como   extração   aquosa,   infusões,   por   solventes,   entre   outras,   sendo   que   estas   extrações   são   geralmente   realizadas  utilizando  flores,  brotos,  sementes,  folhas,  galhos,  cascas,  madeira,  frutos   e   raízes   de   plantas.   Muitos   possuem   efeito   antimicrobiano,   como   por   exemplo   componentes  do  orégano,  cravo,  canela,  alho,  coentro,  alecrim,  salsa,  erva-­cidreira,   sálvia  e  vanilina  (TAJKARIMI;;  IBRAHIM;;  CLIVER,  2010).     Existem  mais   de   1340   plantas   com   compostos   antimicrobianos   definidos,   e   mais  de  30.000  componentes  foram  isolados  a  partir  de  compostos  de  óleo  vegetal   que   contêm   grupos   fenólicos,   que   é   utilizado   na   indústria   alimentícia.   No   entanto,   somente  alguns  óleos  essenciais  possuem  propriedades  como  conservantes  sendo   utilizadas,  portanto  segundo  (BURT,  2004)  há  uma  necessidade  de  mais  avaliações   e  estudos  do  óleo  essencial  na  área  dos  alimentos.     Segundo  Tajkarimi;;  Ibrahim;;  Cliver,  (2010),  antimicrobianos  de  origem  vegetal   são   mais   comumente   produzidos   pela   destilação   a   vapor   (DV)   e   hidrodestilação   (HD)   e   métodos   alternativos,   como   extração   com   fluído   supercrítico   (SFE)   proporcionam   maior   solubilidade   assim   melhorando   as   taxas   de   transferência   de   massa.  Além  disso,  a  manipulação  de  alguns  parâmetros  tais  como  a  temperatura  e   a  pressão  podem  acarretar  a  extração  de  componentes  diferentes,  isso  quando  um   componente  específico  é  necessário.   2.4   Carne  Mecanicamente  Separada  (CMS)     Segundo  a  Instrução  Normativa  nº  4  de  31  de  março  de  2000,  entende-­se  por   Carne  Mecanicamente  Separada   (CMS)  a   carne  obtida  por  processo  mecânico  de   moagem  e  separação  de  ossos  de  animais  de  açougue,  destinada  a  elaboração  de   produtos  cárneos  específicos  (BRASIL,  2000).   Para   a   produção   de   CMS   (Figura   12)   somente   é   permitido   utilizar   ossos,   carcaças  ou  partes  de  carcaças  de  animais  de  açougue  (Aves,  Bovinos  e  Suínos),     31   que   tenham   sido   aprovados   para   consumo   humano   pelo   Serviço   de   Inspeção   Federal  (SIF).  Não  pode  utilizar  outras  partes  como  cabeças,  pés  e  patas  (BRASIL,   2000).   Figura  12  -­  Carne  mecanicamente  separada  (CMS)  de  frango     Fonte:  Google  imagens   As   características   físico-­químicas   básicas   da   CMS   consistem   em:   Proteína   (Mínimo):   12%;;   Gordura   (Máximo):   30%;;   Teor   de   Cálcio   (Máximo):   1,5%   (Base   Seca);;  Diâmetro  dos  Ossos:  98%  deverão  ter  tamanho  (Máximo)  de  0,5  mm;;  Largura   (Máximo)  de  0,85  mm;;  Índice  de  peróxido  (Máximo):  1  mEq  KOH  por  kg  de  gordura   (BRASIL,  2000).   Essa  problemática  em  relação  a  textura  pode  estar  relacionada  em  função  do   processo  de  separação  mecânica,  onde  a  carne  é  retirada  do  osso,  pois  esta  sofre   ruptura  celular,  alguma  desnaturação  proteica  e  um  aumento  de  grupamentos  heme   livres.  Com  isso,  além  da  textura  ser  afetada,  esse  processo  também  pode  afetar  na   coloração   da   carne,   palatabilidade,   sabor   e   carga   microbiana,   tornando-­se   assim   uma  matéria-­prima  altamente  perecível   (BODNER  e  SIEG,  2009),  sendo  assim,  se   esta   não   for   manipulada   adequadamente   pode   acarretar   em   produtos   de   baixa   qualidade.   As   características   físico-­químicas   e  microbiológicas   da  CMS   são   de   grande   importância,  pois  através  delas  pode-­se  determinar  a  sua  qualidade  e  aplicação.     32   A   carne   mecanicamente   separada   deve   atender   aos   requisitos   de   temperatura,  para  garantir  a  sua  qualidade,  isso  pelo  fato  de  ser  uma  carne  bastante   suscetível   a   contaminação.   Então,   segundo   Brasil   (2000),   a   carne   que   não   for   utilizada  diretamente  como  ingrediente  de  um  produto  cárneo,  logo  após  o  processo   de   separação  mecânica,   a  mesma   deverá   ser   refrigerada   a   uma   temperatura   não   superior  a  +  4  ºC,  por  no  máximo  24  horas  ou,  se  armazenada  no  máximo  até  0  ºC,   poderá   ser   utilizada   em   até   72   horas   após   sua   obtenção   e,   também,   se   a   carne   mecanicamente   separada   for   congelada   deverá   ser   em   blocos   com   espessura   máxima  de  15  cm  e  conservada  em   temperatura  não  superior  a   -­18  ºC  pelo  prazo   máximo  de  90  dias.   Nos   padrões   microbiológicos   estabelecidos   pela   legislação   da   carne   mecanicamente   está   previsto   5x10³   UFC/g   de   S.   aureus.   Para   E.   coli   não   há   padrões  estabelecidos  (BRASIL,2000).   A  CMS  provem  a   partir   de   peças   que   sobram  depois   da   desossa   realizada   para  cortes  especiais  de  carne,  pois  estas  peças  possuem  uma  grande  quantidade   de  carne  que  não  foi  totalmente  retirada  dos  ossos,  durante  este  procedimento.  Esta   carne  normalmente  é  utilizada  em  produtos  onde  se  utiliza  carne  triturada  para  sua   elaboração   devido   a   sua   consistência   e   custo   relativamente   baixo   em   relação   a   outros  cortes  de  carne  (PEREIRA  et  al.,  2011).   As   maiores   utilizações   da   CMS   são   em   salsichas,   mortadelas,   patês,   empanados   entre   outros,   pois   esta   carne   possui   características   funcionais   como   textura   gelatinosa,   retenção   de   água   e   também   uma   grande   capacidade   de   emulsionar  a  gordura,  isso  em  função  da  proteína  presente,  estas  propriedades  são   de  grande  valia  na  hora  de  escolher  as  matérias  primas  do  produto  a  ser  elaborado,   porém  algumas  constatações  em  relação  a  textura  da  CMS  em  produtos  acabados   vem   sendo   discutidos,   pois   a   relatos   que   esta   deixa   o   produto   com   uma   textura   muito   mole   (DAROS;;   MASSON;;   AMICO,   2005),   sendo   assim   muitas   vezes   necessário   a   adição   de   coadjuvantes   que   melhoram   a   estabilidade   estrutural   do   produto.     33   2.5   Segurança  alimentar  e  Contaminação   A   definição   de   um   alimento   seguro   pode   ser   dada   em   função   de   seus   constituintes   ou   contaminantes,   que   podem   causar   danos   à   saúde,   estarem   ausentes  ou  em  concentrações  abaixo  do   limite  de  risco  (SOUZA;;  SILVA;;  SOUSA,   2005).  A  segurança  alimentar  pode  ser  afetada  em   função  de  vários   fatores  como   matérias  primas  de  baixa  qualidade  e  contaminadas,  manipulação  inadequada,  uso   inadequado   e   indiscriminado   de   aditivos   químicos,   contaminação   cruzada,   degradação  de  nutrientes  entre  outros.   O   constante   treinamento   para   educação   de   uma   manipulação   adequada   de   alimentos  pode  contribuir  para  aumentar  a  segurança  do  manipulador  no  manuseio   de  alimentos,  com  isso  ampliar  as  perspectivas  educacionais  deste  e  assim  fornecer   à   população   um   alimento   seguro,   do   ponto   de   vista   microbiológico   (LEVINGER,   2005).   Levando   em   consideração   que   as   técnicas   do   controle   da   qualidade   das   indústrias  de  alimentos  estão  cada  vez  mais  avançadas  ainda  a  segurança  alimentar   é   um   item   bastante   problemático   em   relação   a   saúde   pública   (WHO,   2002a).   Segundo   OMS,   (2002),   30%   das   pessoas   de   países   industrializados   sofrem   com   doença  de  origem  alimentar  por  ano.  Outro  dado  alarmante  é  que  no  ano  de  2000   aproximadamente  dois  milhões  de  pessoas  no  mundo  vieram  a  óbito  em  função  de   doenças  diarreicas.     Diante   do   relato   nota-­se   a   necessidade   de   novos   métodos   de   redução   ou   eliminação   de   patógenos   dos   alimentos,   sem   aumentar   a   carga   de   aditivos/conservantes  químicos  artificiais   nos  produtos,  mas   sim  uma  sinergia   com   aditivos  naturais  (BURT,  2004).   A  Organização  Mundial  da  Saúde  está  fazendo  uma  campanha  mundial  para   a  redução  do  consumo  de  sal,  em  função  das  doenças  cardiovasculares  envolvidas   no  consumo  excessivo  de  sal  (WHO,  2002b),  no  entanto,  se  esta  proposta  for  aceita   pelas   indústrias   alimentícias,   alguns   critérios   de   formulação   dos   produtos   deverão   ser   revistos,  pois    sabe-­se  que  o  sal  possui  característica  antimicrobiana,  portanto,   se   reduzido   o   seu   teor,   o   alimento   estará  mais   propenso  a   contaminações,   sendo     34   assim   necessária   a   adição   de   outros   aditivos   para   manter   a   segurança   dos   alimentos,   levando   tudo   isso  em  consideração,  uma  ótima  opção  é  o  uso  de  óleos   essenciais  com  características  antimicrobianas  (BURT,  2004),  além  de  ter  o  papel  de   conservante   os   óleos  essenciais   possuem  um  apelo  mercadológicos  muito   grande   por  ser  natural.   2.6   Microrganismos  patogênicos   A   contaminação   por   microrganismos   patogênicos   pode   ocorrer   em   toda   a   cadeia   produtiva,   desde   a   produção   primária   (plantio,   manuseio,   transporte,   cozimento,   acondicionamento)   até   o   consumo.  Vários   dados   disponíveis   de   surtos   de   intoxicação/infecção   alimentar   apontam   como   agentes   mais   frequentes   os   de   origem   bacteriana,   sendo   eles   Salmonella   spp,   Escherichia   coli,   Staphylococcus   aureus,  Shigella  spp,  Bacillus  cereus  e  Clostridium  perfringens  (BRASIL,  2010).     L.   monocytogenes,   S.   aureus,   S.   entérica   e   E.   coli   são   conhecidos   como   microrganismos   patogênicos   (transmissores   de   doenças)   e   são   frequentemente   isoladas  de  carnes  ou  seus  derivados  (BORCH  e  ARINDER,  2002).     A  deterioração  de  um  alimento  normalmente  é  devido  a  presença  de  bactérias   nos   alimentos,   com   isso   reduzindo   sua   vida   de   prateleira   e   possibilitando   ainda   a   veiculação   de   patógenos,   acarretando   potenciais   riscos   à   saúde   pública.   Sendo   assim   é   necessário   um   controle   efetivo   para   garantia   da   qualidade   em   todos   os   estágios  de  sua  elaboração  até  o  produto  final  (CARVALHO;;  CORTEZ,  2005).   Os  alimentos  de  origem  animal   ou   vegetal   apresentam  em  sua  origem  uma   microbiota   habitual.   A   grande   dificuldade   é   impedir   a   colonização   natural   por   esta   microbiota,   além   da   contaminação   por   outros   microrganismos   durante   o   processamento   dos   alimentos.   Os   principais   agentes   patogênicos   têm   como   características   em   comum:   curto   período   de   incubação,   quadro   clínico   gastrointestinal,   acompanhado   ou   não   de   febre.   As   complicações   decorrentes   das   doenças   causadas   por   alimentos   contaminados   vêm   aumentando   gradativamente,   sendo   responsáveis   por   alto   número   de   hospitalizações   e,   em   alguns   casos,   com   consequências  irreversíveis  ao  paciente  (GERMANO  e  GERMANO,  2003).       35   Normalmente  os  microrganismos  envolvidos  nos  processos  de  contaminações   de  alimentos  são  as  bactérias, pois  estas  sobrevivem  em  vários  tipos  de  substratos,   com   diferentes   temperaturas,   pH,   e   condições   do   meio   ambiente.   Levando   em   consideração   que   muitos   microrganismos   estão   se   tornando   resistentes   a   sanitizantes   e   antibióticos,   e   também   tendo   em   vista   a   tendência   do   mercado   de   utilizar   produtos   ecologicamente   seguros,   a   utilização   de   óleos   essenciais   como   conservante   natural   vem   sendo   muito   cogitado   e   estudado,   com   isso   gerando   o   desenvolvimento   de   novas   técnicas   e   produtos   que   potencializam   a   redução   dos   efeitos  negativos  de  oxidantes  e  microrganismos  causadores  de  grandes  prejuízos   às  indústrias  alimentícias  (PEREIRA  et  al.,  2008).   2.6.1   Escherichia  coli  e  sua  contaminação   Coliformes  totais  é  um  grupo  de  bactérias  da  família  Enterobacteriaceae,  não   são   formadores   de   esporos,   são   Gram-­negativos   em   forma   de   bacilos,   anaeróbio   facultativo,   e   quando   submetidos   a   uma   incubação   a   35   –   37   oC/48h   estes   são   capazes   de   fermentar   a   lactose   produzindo   assim   gás.   Uma   representante   deste   grupo  é  a  Escherichia  coli,  sendo  que  esta   tem  seu  hábitat   inicial  o   trato   intestinal   dos   animais   e   humanos,   e   sob   incubação   a   44-­45,5   oC,   possui   a   capacidade   de   continuar  a  formar  gás  a  partir  da  fermentação  da  lactose  (FRANCO  e  LANDGRAF,   2008).   E.  coli  é  encontrada  nas  fezes  de  animais  de  sangue  quente,  incluindo  seres   humanos,  em  concentrações  relativamente  altas,  sendo  que  esta  pode  variar  de  106   a   107   células/g   nas   fezes   de   humanos.   Este   microrganismo   é   há   muito   tempo   reconhecido  por  sobreviver  muito  bem  no  meio  ambiente,  motivo  pelo  qual  pode  ser   considerado  um  indicador  de  contaminação  fecal  em  água  e  alimentos,  mais  antigo   já  relatado  (LUNESTAD  et  al.,  2016).   A  E.  coli  possui  diferentes   linhagens   já   identificadas  como  patogênicas  tanto   para   o   homem   quanto   para   animais,   sendo   que   estas   podem   acarretar   infecções   graves,  muitas  vezes  podendo  levar  o  enfermo  a  óbito.  Esse  microrganismo  muitas   vezes  pode  estar  em  pequenas  quantidades  em  um  alimento  recém  processado  ou   manipulado,   porém   se   este   alimento   for   armazenado   de   forma   inadequada   pode     36   permitir  a  multiplicação  deste  causando  uma  infecção  intestinal  (LEITE  e  FRANCO,   2006).   Um   dos   principais   atributos   da   qualidade   microbiológica   é   indicar   a   integridade   dos   produtos   alimentícios   e   da   higiene   com   que   estes   foram   processados.  As  análises  de  coliformes  e  da  E.  coli   foram  adotadas  mundialmente   pelas   indústrias   de   alimentos   pelo   fato   de   que   principalmente   a   E.   coli   sugere   contaminações  de  origem  fecal,  diretas  ou   indiretas  dos  seres  humanos  e  animais.   Elevada   contagem   de   E.   coli   e   coliformes   totais   em   amostras   de   alimentos   demonstram   ou   indicam   uma   deficiência   nas   boas   práticas   de   fabricação   (SANGADKIT  et  al.,  2012).   A  E.  coli  coloniza  o  intestino  humano  algumas  horas  após  o  nascimento  não   causando   enfermidades.   Essa   interação   com   as   células   epiteliais   intestinais   é   benéfica  e,  nesse  contexto,  E.  coli  atua  competindo,  criando  uma  barreira  para  que   os  patógenos  não  colonizem  o   intestino.  Porém,  essa  bactéria  pode  agir  como  um   organismo  que  se  aproveita  de  indivíduos  que  estão  fragilizados,  causando  doenças,   infecções  em  tecidos  e  órgãos  saudáveis  (SOUSA,  2006).   Ao  se  contaminar  com  esta  bactéria  o  indivíduo  pode  sofrer  de  infecções  que   podem   ocorrer   somente   em   mucosas   ou   podem   se   alastrar   pelo   organismo   causando   infecções   gastrointestinais.   Os   sintomas   podem   ser   desde   diarreias,   vômitos,  dores  de  cabeça,  cólicas  entre  outras,  não  tendo  um  tratamento  específico,   porém  o  excesso  de  vómito  e  diarreia  pode  causar  grave  desidratação,  então  o  que   se  recomenda  é  uma  ingestão  maior  de  líquidos  para  hidratar  (SOUSA,  2006).   A  contaminação  com  E.  coli  pode  se  dar  em  função  do  consumo  de  alimentos   com   deficiências   no   processo   de   fabricação,   sendo   esta   muitas   vezes   uma   contaminação  cruzada  advinda  da  falta  de  higiene  pessoal,  manipulação  inadequada   por  parte  do  colaborador  ou  também  matéria  prima  e  processos  em  desacordo  com   os  princípios  higiênico  sanitários.   2.6.2   Staphylococcus  aureus  e  sua  Contaminação   O  Staphylococcus  aureus,  é  do  gênero  Staphylococcus  e   filo  Firmicutes,  é  a   espécie  mais   significativa   pelo   fato   de   ser   patogênica,   é   um  microrganismo  Gram     37   positivo,   anaeróbio   facultativo   e   se   apresenta   em   forma   de   cocos,   sendo   que   a   enterotoxina  produzida  pelo  Staphylococcus  aureus  é  uma  das  grandes  causadoras   de  intoxicações  alimentares  (TORTORA;;  FUNKE;;  CASE,  2005).   Segundo  Costa  (2008),  Escherichia,  Salmonella,  Shigella,  Yersinia,  Klebsiella,   Vibrio   e   os   gêneros  Staphylococcus   e  Streptococcus   são   os  microrganismos  mais   encontrados   em   caso   de   intoxicação   alimentar.   Estes   destroem   a   flora   intestinal   através  da  sua  proliferação  ou  ação  das  suas  enterotoxinas.  Diarreia,  vômito,  dores   abdominais,   náuseas,   sudorese   e   cefaleia   são   os   principais   sintomas   de   uma   pessoa  com  intoxicação  alimentar.   Tan;;   Lee;;   Mahyudin,   (2014)   relatam   que   uma   das   maiores   fontes   de   contaminação   é   advinda   dos   manipuladores   de   alimentos   em   função   da   contaminação  cruzada,  sendo  que  este  microrganismo  em  contato  com  o  alimento   encontra  um  ambiente  propício  para  sua  proliferação  e  com  isso  a  produção  de  uma   toxina  termoestável,  assim,  causando  uma  intoxicação  alimentar  no  consumidor.         38     3   METODOLOGIA   Para  este  trabalho  utilizou-­se  dois  condimentos,  Gengibre  (Zingiber  officinale)   in   natura   e   Alecrim   (Rosmarinus   officinalis)   seco,   sendo   que   destes   realizou-­se   a   extração  de  óleo  essencial  utilizando  o  aparelho  de  Clevenger  modificado  e  extração   aquosa  por  infusão.     Depois  de  ter  realizado  as  extrações  dos  óleos,  analisou-­se  sua  composição   (cromatografia)   e   atividade   antimicrobiana   (Concentração   inibitória   mínima   e   Concentração   bactericida   mínima).   Diante   destes   resultados,   dosou-­se   o   óleo   essencial   em   CMS   previamente   esterilizada   e   posteriormente   contaminada   com   Escherichia   coli   e  Staphylococcus   aureus,   e,   por   fim,   analisou-­se   a   diminuição   ou   eliminação   dos   microrganismos.   Realizou-­se   todos   os   procedimentos   nos   laboratórios   da   instituição   sendo   estes   em   triplicata.   Decidiu-­se   não   utilizar   os   extratos  em  função  sua  baixa  performance  em  relação  a  ação  antimicrobiana.   3.1   Amostras   As   amostras   de   folhas   secas   de   alecrim   foram   adquiridas   em   uma   loja   de   produtos  naturais  de  Lajeado-­RS.  Adquiriu-­se  a  raiz  de  gengibre  de  uma  fruteira  em   Montenegro-­RS  e  a  CMS,  de  uma  empresa  do  Vale  do  Taquari,  RS.     39   3.2   Obtenção  dos  extratos   3.2.1   Óleo  essencial     Levando  em  consideração  a  Farmacopeia  Brasileira   (1988-­2005)   realizou-­se   a   extração   através   da   destilação   por   arraste   de   vapor   de   água   com   auxílio   do   aparelho  Clevenger  modificado  (Figura  13),  onde,   triturou-­se  os  condimentos,  após   colocou-­se  em  um  balão  de  fundo  redondo  de  5  L,  com  aproximadamente  de  3  L  de   água  destilada.  Aqueceu-­se  o  sistema  até  a   fervura,  assim  ocorrendo  o  arraste  do   óleo  essencial  pelo  vapor-­de-­água.  Após  a  condensação,  os  líquidos  (óleo  essencial   e  água)  se  separam  no  extrator.  Após  um  período  de  três  horas  e  meia,  removeu-­se   o   óleo   por   gravidade   para   um   recipiente   adequado.   Então   tratou-­se   o   óleo   com   Na2SO4   anidro   para   remoção   da   água   residual,   calculou-­se   o   rendimento   e   armazenou-­se  sob  refrigeração  e  ao  abrigo  da  luz,  até  o  momento  da  sua  utilização.   Figura  13  -­  Aparelho  de  extração  Clevenger  modificado     Fonte:    Da  autora       40   3.2.2   Extrato  aquoso   Obteve-­se  o  extrato  aquoso  pelo  método  de  infusão,  utilizando  como  solvente   água   destilada.   Reduziu-­se   condimento   a   fragmentos   de   pequena   dimensão,   utilizando  um  liquidificador  industrial.  Em  seguida,  adicionou-­se  100  g  de  condimento   em  1000  mL   de   água   destilada   fervente   (90   ºC),   repousando   durante   30  minutos.   Após,  filtrou-­se  o  material  e  utilizou-­se  o  rota-­evaporador  BÜCHI  R3  para  a  remoção   da  água  sendo  este  em  banho  termostatizado  Marconi  MA-­184,  em  temperatura  de   40   ºC.   Ao   final,   calculou-­se   o   rendimento   e   guardou-­se   os   extratos   totais   sob   refrigeração  e  ao  abrigo  da  luz  até  sua  utilização.   3.3   Processos  de  purificação  e  identificação   3.3.1   Análise  da  composição  química  do  óleo  essencial   Identificou-­se  os  constituintes  dos  óleos  essenciais  através  de  cromatografia   gasosa   acoplada   a   espectrometria   de   massas   (CG-­EM)   juntamente   com   a   determinação  do  índice  de  retenção  de  Kovats  (IK).   3.3.2   Cromatografia  gasosa  e  o  Índice  de  Kovats   Realizou-­se   a   análise   do   óleo   essencial   na   Central   Instrumental   do   Centro   Tecnológico  de  Pesquisa  e  Produção  de  Alimentos  –  CTPPA  –  da  UNIVATES.   Solubilizou-­se   alíquotas   de   1,5   µL   dos   óleos   essenciais   em   1,5   mL   de   n-­ hexano  bidestilado  e  em  um  cromatógrafo  a  gás  Shimadzu  (modelo  GC2010  Plus)   acoplado   a   um   detector   de  massas   do  mesmo   fabricante   (modelo   GCMSQP2110   Ultra),  operado  a  70  eV,  em  coluna  capilar  de  sílica  fundida  Rtx®-­5MS  (30  m  x  0,25   mm   x   0,25   μm).   Como   gás   de   arraste   empregou-­se   o   hélio.   As   injeções   das   amostras  foram  da  ordem  de  1  μL,  utilizando  autoinjetor  AOC-­5000  Plus  (Shimadzu).   Para  a  análise  empregou-­se  as  seguintes  condições:  temperatura  do  injetor:  240  ºC;;   modo  de   injeção:   razão  de  split  1:20  com  purga  de  3  mL/min;;  controle  de   fluxo  de   gás:   velocidade   linear;;   fluxo   de   gás   de   arraste:   1,00   mL/min;;   programa:   50  ºC,   290  ºC   (4  ºC/min);;   temperatura   da   interface   do   espectrômetro   de  massas:   280  ºC,   temperatura   da   fonte   de   íons:   260  ºC.   Identificou-­se   a   maioria   dos   constituintes     41   utilizando   o   índice   de   Kovats   em   comparação   com   uma   mistura   de   nalcanos,   espectros  de  massas  de  padrões  puros  (NIST111,  2011)  e  comparação  com  dados   da  literatura  (ADAMS,  2009).   Para   o   cálculo   do   índice   de   retenção   de   Kovats   (IK   ou   Ir),   utilizou-­se   uma   mistura  de  padrões  de  alcanos  não  ramificados  (C7  a  C30  –  Sigma-­Aldrich  49451-­ U).  Diluiu-­se  esta  amostra  em  n-­hexano  e  analisou-­se.  Os  índices  de  retenção  dos   compostos   foram   obtidos   de   acordo   com   a   equação   abaixo   (VAN   DEN   DOOL   e   KRATZ,  1963):   Iri  =  100  a  +  ∆n   tri  -­  tra trb  -­  tra   onde:   •   Iri  =  índice  de  retenção  i   •   i  =  constituinte  do  óleo  essencial  que  está  sendo  analisado.   •   a  =  número  de  carbonos  do  alcano  que  elui  antes  de  i.   •   b  =  número  de  carbonos  do  alcano  que  elui  depois  de  i.   •   Δn  =  número  de  carbonos  do  alcano  que  elui  depois  de   i  menos  número  de   carbonos  do  alcano  que  elui  antes  de  i.   •   tri  =  tempo  de  retenção  de  i.   •   tra  =  tempo  de  retenção  do  alcano  que  elui  antes  de  i.   •   trb  =  tempo  de  retenção  do  alcano  que  elui  depois  de  i.   3.4   Aspectos  químicos  e  biológicos   3.4.1   Atividade  antimicrobiana   Para   a   avaliação   da   atividade   antimicrobiana   e   da   Concentração   Inibitória   Mínima   (CIM),   utilizou-­se   a   linhagem   padrão   American   Type   Culture   Collection   (ATCC)  de  Escherichia  coli  (  ATCC  25922)  e  Staphylococcus  aureus  (ATCC  6538P).   Os  microrganismos  liofilizados  foram  cedidos  pelo  Laboratório  de  Microrganismos  de   Referência  da  Fundação  Oswaldo  Cruz  –  FIOCRUZ.     42   3.4.1.1   Diluição  do  extrato  e  do  óleo  essencial   Para   a   obtenção   da   solução   de   trabalho   pesou-­se   0,2   g   de   cada   extrato   e   transferiu-­se   para   balão   volumétrico   de   5   mL.   Adicionou-­se   0,04   mL   de   DMSO   e   uma  porção  de  água  deionizada  estéril.  Após  a  solubilização  do  extrato,  com  auxílio   de   uma   pipeta   de   Pasteur,   completou-­se   o   volume   com   água   deionizada   estéril.   Desta  forma,  obteve-­se  uma  solução  de  40  mg/mL.   Para   obtenção   da   solução   de   óleo   essencial   pesou-­se   0,2   g   de   óleo   e   adicionou-­se  0,04  mL  de  Twem  e  adicionou-­se  água  deionizada  estéril  até  completar   5   mL.   Após   a   solubilização   do   extrato,   com   auxílio   de   uma   pipeta   de   Pasteur,   completou-­se   o   volume   com   água   deionizada   estéril.   Desta   forma,   obteve-­se   uma   solução  de  40  mg/mL   3.4.1.2   Substância  empregada  como  padrão  antimicrobiano   Utilizou-­se  a  gentamicina  0,2  mg/mL,  como  padrão  antibiótico  para  verificação   da  atividade  antimicrobiana.   3.4.1.3   Controle  do  diluente   Preparou-­se   uma   solução   para   o   controle   do   diluente.   Em   um   balão   volumétrico   de   5   mL,   adicionou-­se   0,04   mL   de   DMSO   (Dimetilsulfóxido)   para   o   extrato  aquoso  e  Twem  para  o  óleo  essencial  e  completou-­se  o  volume  com  água   destilada  estéril.   3.4.1.4   Padronização  do  inóculo   A   partir   das   linhagens   bacterianas   liofilizadas,   reidratou-­se   as   culturas,   ressuspendendo  o  sedimento  com  0,3  a  0,5  mL  do  meio   líquido   recomendado  em   Muller  Hinton  a  37  ºC/24 horas.  Após  ocorrido  o  crescimento  bacteriano,  preparou-­se   as  suspensões  microbianas.  Para  isso  adicionou-­se  uma  alçada  do  microrganismo  a   10  mL  de  solução  salina  0,8  %  estéril  até  a  obtenção  de  uma  turbidez  equivalente  à   escala  nefelométrica  de  McFarland  em  0,5,  que  é  indicativo  da  presença  de  1,5  x  108   UFC/mL.  Para  garantir  a  quantidade  de  inóculo  presente,  realizou-­se  o  indicado  pelo   NCCLS   (2003),   onde  então   realizou-­se   a   leitura   da   turbidez   em  espectrofotômetro     43   UV-­VIS  Genesys  10S  UV-­VIS,  no  comprimento  de  onda  625  nm  com  o  propósito  de   garantir   que   o   padrão   produzido   estava   de   acordo   com   o   descrito   pela   literatura   (0,08  a  0,13  nm).   3.4.1.5   Concentração  Inibitória  Mínima  –  CIM   Realizou-­se   a   determinação  da   concentração   inibitória  mínima  dos   extratos,   segundo   a  metodologia   da   diluição   em   caldo   (microdiluição),   conforme   as   normas   descritas   pelo   "Clinical   and   Laboratory   Standards   Institute"   (CLSI)   (NCCLS   document   M07-­A9,   2012),   onde   utilizou-­se   placas   de   acrílico   com   96   poços,   de   acordo   com  a   (Figura  14).  Em  cada  placa  aplicou-­se  os  extratos,   o  antimicrobiano   (gentamicina)   e   o   diluente   (DMSO),   todos   em   triplicata.   Também   colocou-­se   os   controles   negativos   (meio   sem  adição  de   inóculo)   e   controles   positivos   (meio   com   adição  de  inóculo).   Realizou-­se   a   microdiluição   em   capela   de   fluxo   laminar.   Inicialmente   transferiu-­se   alíquotas   de   200   µL   do   inóculo   padronizado   a   tubos   de   ensaio   contendo   10  mL   de   caldo  Mueller   Hinton   (200   µL   em   cada)   sendo   que   deixou-­se   alguns  tubos  sem  inóculo  (controle  negativo).   Após  a  inoculação,  incubou-­se  as  placas.  Transcorrido  o  tempo  de  incubação,   realizou-­se   a   leitura   das   mesmas.   A   confirmação   de   crescimento   bacteriano   é   representada  pela   turvação  do  poço  e  a  ausência  de  crescimento   foi   representada   pelo   poço   límpido.   O   primeiro   poço   onde   não   se   observa   crescimento   (de   maior   diluição)  corresponde  ao  valor  da  concentração  inibitória  mínima.     44   Figura  14  -­  Placa  de  96  poços  para  a  confirmação  da  CIM     Fonte:  Da  autora   3.4.1.6   Confirmação  da  Concentração  Inibitória  Mínima     Como   os   extratos   possuem   coloração,   realizou-­se   a   confirmação   de   crescimentos  nos  poços  por  meio  da  aplicação  da  solução  aquosa  estéril  de  cloreto   de   trifeniltetrazólio   0,5%   (TTC).   Essa   solução   revela   o   crescimento   bacteriano   por   meio   do   desenvolvimento   de   uma   coloração   vermelha,   pois   forma   um   complexo   vermelho   com   a   enzima   da   respiração   celular   dos   organismos   vivos,   assim   nos   poços  onde  há  crescimento  bacteriano  haverá  o  desenvolvimento  da  coloração.   3.4.1.7   Determinação  da  Concentração  Bactericida  Mínima  (CBM)   Para  determinação  da  concentração  bactericida  mínima  do  extrato  aquoso  e   do   óleo   essencial   realizou-­se   semeaduras   em   placas   de   ágar   Muller   Hinton   (Figura  15)  de  todos  os  poços  onde  o  extrato  se  apresentou  límpido,  para  afirmar  a   ação  do  mesmo.  Incubou-­se  estas  placas  a  36  ºC  +/-­  1  ºC  por  24  horas.     45   Para   interpretação   dos   resultados   considerou-­se   os   seguintes   critérios:   o   crescimento  do  microrganismo  no  meio  de  cultura  significa  ação  bacteriostática;;  e  a   ausência   de   crescimento   do   microrganismo   no   meio   de   cultura   significa   ação   bactericida.   Figura  15  -­  Placa  de  Petri  com  Muller  Hinton  para  confirmação  da  CBM     Fonte:  Da  autora   3.4.2   Análises   de   contagem   bacteriana   da   carne   mecanicamente   separada   (CMS)  contaminada  adicionada  de  óleo  essencial   Primeiramente  buscou-­se  a  CMS  na  empresa  fornecedora,  tomando  todos  os   cuidados  de  transporte,  após  esterilizou-­se,  em  autoclave  a  121  oC  por  15  min.,  uma   porção  suficiente  para  as  amostragens.  As  amostras  foram  constituídas  de  10  g  de   CMS   esterilizada,   pesadas   em   sacos   de   stomacher   estéreis,   onde   adicionou-­se   primeiramente  e  1  mL  do  inóculo,  homogeneizou-­se  bem  e,  após,  adicionou-­se  três   concentrações  do  óleo,  C1  (1  µL/g),  C2  (5  µL/g)  e  C3  (10  µL/g),  homogeneizou-­se   novamente.  Por   fim  analisou-­se  o  crescimento  bacteriano  das  amostras  em  quatro   tempos,   T0   (0   horas),   T1   (24   horas),   T2   (48   horas)   e   T3   (72   horas),   sendo   que   realizou-­se   quatro   diluições   seriadas   para   cada   amostra,   como   descrito   a   seguir.   Também   realizou-­se   uma   controle   negativo   1B   (carne)   e   um   positivo   2B   (carne   +   microrganismo),  sendo  estes  realizados  para  cada  tempo  e  microrganismo.  Todas  as   análises  foram  realizadas  em  triplicata.   Preparação  do  inóculo:     46   Para  os  dois  microrganismos  realizou-­se  uma  suspensão  bacteriana  ajustada   a  0,5  da  escala  de  McFarland,  sendo  que  esta  corresponde  a  108  UFC/mL  (Unidades   formadoras  de  colônias).  Desta  suspensão  retirou-­se  1  mL  e   transferiu-­se  para  um   tubo  contendo  9  mL  de  solução  salina  peptonada,  gerando  a  diluição  107  UFC/mL,   sendo   que   desta   diluição   transferiu-­se   1  mL   para   a   primeira   amostra   gerando   106   UFC,  e  assim  sucessivamente  até  103  UFC.   Para   as   análises   de   coliformes   termotolerantes   e   Staphylococcus   aureus,   utilizou-­se   a   metodologia   adaptada   de   Brasil   (2003),   que   serão   detalhadas   nas   subseções  seguintes.   3.4.2.1   Análise  de  contagem  de  coliformes  termotolerantes   Pesou-­se  10  g  da  amostra.  Adicionou-­se  90  mL  de  solução  salina  peptonada   0,1  %.  Homogeneizou-­se  por  aproximadamente  60  segundos  em  “stomacher”.   Prova  presuntiva     Inoculação:   A  partir  da  diluição   inicial,  efetuou-­se  as  demais  diluições  em  solução  salina   peptonada  0,1%.  Inoculou-­se  1  mL  de  cada  diluição  em  placas  de  Petri  esterilizadas.   Adicionou-­se   a   cada   placa   cerca   de   15  mL   de   (Ágar   bile   vermelho   violeta)   VRBA   previamente  fundido  e  mantido  a  46  °C  –  48  ºC  em  banho-­maria.  Homogeneizou-­se   cuidadosamente  e  deixou-­se  em  repouso  até  total  solidificação  do  meio.  Adicionou-­ se,   sobre   cada  placa,   cerca  de  10  mL  de  VRBA  previamente   fundido  e  mantido  a       46  ºC  –  48  °C  em  banho-­maria,  formando  uma  segunda  camada  de  meio.  Deixou-­se   solidificar.   Incubação:   Após   completa   solidificação   do   meio,   incubou-­se   as   placas   em   posição   invertida  em  temperatura  de  36  ±  1  °C  por  18  a  24  horas.     Leitura:   Selecionou-­se  placas  que  continham  entre  15  e  150  colônias.  Contou-­se  as   colônias  que  apresentavam  morfologia  típica  de  coliformes,  ou  seja,  colônias  róseas     47   com  0,5  a  2  mm  de  diâmetro  rodeadas  ou  não  por  uma  zona  de  precipitação  da  bile   presente  no  meio.  Anotou-­se  os  resultados  de  contagem.     3.4.2.2   Contagem  de  Staphylococcus  aureus   1)  Pesagem  e  preparo  da  amostra:  Pesou-­se  10  g  da  amostra,  adicionou-­se   90  mL  de  solução  salina  peptonada  0,1%.  Homogeneizou-­se  por  aproximadamente   60  segundos  em  “stomacher”.     2)   Inoculação:  A  partir   da  diluição   inicial,   efetuou-­se  as  diluições  desejadas.   Inoculou-­se,  sobre  a  superfície  seca  do  ágar  Baird-­Parker,  0,1  mL  de  cada  diluição   selecionada.   Com   o   auxílio   de   alça   de   Drigalski,   espalhou-­se   o   inóculo   cuidadosamente  por  toda  a  superfície  do  meio,  até  sua  completa  absorção.   3)  Incubação:  Incubou-­se  as  placas  invertidas  a  36  ±  1  ºC  por  30  a  48  horas.     4)  Leitura:  Selecionou-­se  as  placas  que  continham  entre  20  e  200  colônias.   Contou-­se  as  colônias.         48     4   RESULTADOS  E  DISCUSSÕES   4.1   Rendimento  dos  extratos   Primeiramente,  determinou-­se  o  rendimento  do  óleo  essencial  de  gengibre  e   alecrim   e   posteriormente   o   rendimento   do   extrato   aquoso   dos  mesmos,   conforme   resultados  demostrados  na  Tabela  1.   Tabela  1  -­  Rendimento  do  óleo  essencial  e  do  extrato  aquoso  de  alecrim  e  gengibre     %  Rendimento   Planta   Óleo  essencial   Extrato  aquoso   Alecrim  (Rosmarinus  officinalis  L.)   1,97   14,98   Gengibre  (Zingiber  officinale)   0,18   5,02     Na  Tabela  1  verifica-­se  que  o  alecrim  teve  um  rendimento  maior  tanto  para  o   extrato  aquoso  quanto  para  o  óleo  essencial,  em  relação  ao  gengibre.  Obteve-­se  um   rendimento   de   1,97%   e   0,18%   para   o   óleo,   respectivamente,   e   para   os   extratos   aquosos   de   alecrim   e   gengibre,   tendo   um   rendimento   de   14,98   e   5,02%,   respectivamente.   Zaouali;;   Bouzaine;;   Boussaid   (2010)   analisaram   seis   amostras   de   alecrim,   onde  obteve   rendimentos  dos  óleos  essenciais   que   variaram  entre   1,17%  a  2,7%,   corroborando  assim  com  o  encontrado  Tabela  1.   Uçar  et  al.  (2013),  em  seus  experimentos,  obtiveram  16%  de  extrato  aquoso   de  alecrim,  demostrando  assim  uma  proximidade  ao  encontrado,  Tabela  1.     49   Pereira   et   al.   (2007)   encontraram   em   seus   estudos   com   gengibre   um   rendimento  de  óleo  essencial  que  variaram  de  0,3  ±  0,02%  em  base  úmida,  sendo   que   no   experimento   deste   relatório   encontrou-­se   0,18%,   estando   próximo   ao   que   este  autor  encontrou.   Yehb   et   al.   (2014),   pesquisaram   duas   espécies   de   gengibre   (Zingiber   officinale  Roscoe),   onde   encontrou   15,84%   e   10,86%   de   extrato   aquoso,   não   condizendo   com   o   encontrado   nesta   pesquisa   Tabela   1,   esta   diferença   pode   ter   ocorrido  em  função  das  espécies  serem  diferentes  ou  até  mesmo  a  região  em  que   foi  plantada.   4.2   Análise  cromatográfica  dos  óleos  essenciais  de  alecrim  e  gengibre     Na   Figura   16   pode-­se   observar   o   cromatograma   do   óleo   de   alecrim,   onde   pode-­se   verificar   a   presença   de   18   sinais   entre   5   e   25   minutos   de   corrida   cromatográfica.   Na   Tabela   2   estão   relacionados   os   componentes   encontrados   do   óleo   de   alecrim,   onde   pode-­se   verificar   que   18   componentes   foram   identificados,   atingindo  99,67%  de  um  total  de  100%,  sendo  que  desse  identificados  98,28%  são   monoterpenos   (11,4%   monoterpenos   hidrocarbonetos   e   88,27%   monoterpenos   oxigenados)   e   por   fim   1,39%   são   os   sesquiterpenos   oxigenados,   neste   total   encontram-­se   os   compostos   majoritários   como,   1,8-­cineol   (40,77%),   cânfora   (22,27%),  borneol  (9,73%)  e  α-­terpineol  (5,14%).   Figura  16  -­  Cromatograma  do  óleo  essencial  de  alecrim     Fonte:  Da  autora     50     Tabela  2  -­  Componentes  do  óleo  essencial  de  alecrim   IK  exp.:  Índice  de  Kovats  experimental;;  IK  lit.:  Índice  de  Kovats  literatura;;  TR:  Tempo   de  retenção.   Zaouali;;   Bouzaine;;   Boussaid   (2010)   encontraram   25   componentes   representando   93,6%   de   97,5%   do   total,   onde   os   majoritários   foram   1,8   cineol   (40,0%),   cânfora   (17,9%),   α-­pineno   (10,3%),   e   canfeno   (6,3%).   Os   monotepenos   hidrocarbonetos  (64%),  cetonas  constituem  (18%).  Esses  para  a  espécie  analisada   em   seu   estudo.   Levando   em   consideração   esses   resultados,   principalmente   a     51   porcentagem  do  1,8-­cineol,  pode-­se  dizer  que  há  uma  relação  com  o  encontrado  no   presente  estudo  conforme  Tabela  2.     Pesavento   et   al.   (2015)   encontraram   99,9%   dos   componentes   do   óleo   de   alecrim.  Os  componentes  mais  importantes  foram  representados  por  monoterpenos   oxigenados   (64,6%),   sendo   o   principal   1,8-­cineol   (43,9%),   os   monoterpenos   hidrocarbonetos   totalizaram   25,9%,   onde   o   α-­pineno   é   o   principal   e   os   sesquiterpenos   hidrocarbonetos   foram   de   9,1%   e   sesquiterpenos   oxigenados   de   apenas  0,3%,  o  que  também  condiz  ao  encontrado  no  presente  estudo.   Na  Figura  17  pode-­se  observar  a  presença  de  12  dos  principais  sinais  entre  5   e   25   minutos   de   corrida   cromatográfica.   Na   Tabela   3   estão   descritos   os   componentes  encontrados  do  óleo  de  gengibre,  onde  verifica-­se  que  12  compostos   identificados,  atingindo  97,10%  de  um  total  de  100%,  sendo  que  desse  identificados   42,93%   são   monoterpenos   (8,25%   monoterpenos   hidrocarbonetos   e   34,68%   monoterpenos   oxigenados)   e   por   fim   uma   maior   porcentagem   de   54,17%   são   sesquiterpenos  hidrocarboneto,  neste  total  encontram-­se  os  compostos  majoritários   como,  α-­zingibereno  24,20%,  geraniale  15,71%,  β-­bisaboleno  12,73%,  neral  10,61%,   β-­sesquifelandreno  10,07%,  γ-­curcumeno  7,17%  e  β-­felandreno  6,75%.   Figura  17  -­  Cromatograma  do  óleo  essencial  de  gengibre     Fonte:  Da  autora           52     Tabela  3  -­  Componentes  do  óleo  de  gengibre   IK  exp.:  Índice  de  Kovats  experimental;;  IK  lit.:  Índice  de  Kovats  literatura;;  TR:  Tempo   de  retenção.   Koroch  et  al.  (2007)  encontraram,  ao  analisar  o  óleo  essencial  de  gengibre  de   uma  espécie  do  Madagascar,  11  componentes  que  totalizaram  96,6%  sendo  que  os   majoritários  foram  α-­zingibereno  22,9%,  Geraniale  14,6%,  β-­bisaboleno  8,5%,  Neral   6,4%,   β-­sesquifelandreno   6,5%,   γ-­curcumeno   7,7%   e   β-­felandreno   0,9%,   pode-­se   verificar  semelhanças  com  o  encontrado  no  óleo  deste  experimento.   Nos   estudos   da   composição   do   óleo   de   gengibre   fresco,   An   et   al.   (2016)   encontraram   zingibereno   (22,76%),   β-­felandreno   (12,40%),   β-­sesquiphellandrene   (7,01%),   geranial   (14,50%),   α-­curcumeno   (2,78%)   e   β-­bisaboleno   (3,25%),   o   que   condiz  com  os  compostos  majoritários  encontrados  no  presente  estudo.       53   Algumas  diferenças  na  composição  e  rendimento  dos  óleos,  normalmente  se   da   em   função   do   local   do   plantio   (tipo   de   solo),   estresse   em   que   a   planta   foi   submetida,  método  de  extração,  secagem,  período  da  colheita  entre  outros.   4.3   Atividade  antimicrobiana   Analisou-­se   a   concentração   mínima   inibitória   (CIM)   e   concentração   bactericida   mínima   (CBM)   frente   a  E.   coli   e   ao  S.   aureus   com   diluições   seriadas   partindo  da  concentração  de  20  mg/mL  até  0,625  mg/mL.   Para  a  E.  coli  utilizando  o  extrato  aquoso  de  alecrim  verificou-­se,  (Tabela  4),   uma  CIM  de  5,0  mg/mL  e  CBM  >20  mg/mL,  enquanto  o  extrato  aquoso  de  gengibre   uma   CIM   de   20   mg/mL   e   CBM   >20   mg/mL.   Para   o   óleo   essencial   de   alecrim   constatou-­se   uma  CIM   de   1,25  mg/mL   e  CBM   de   2,5  mg/mL,   enquanto   o   óleo   de   gengibre  uma  CIM  de  1,25  mg/mL  e  CBM  de  5,0  mg/mL.   Tabela  4  -­  Resultados  da  Concentração  Inibitória  Mínima  (CIM)  e  Concentração   Bactericida  Mínima  (CBM)  frente  a  E.  coli  do  alecrim  e  do  gengibre     Óleo  essencial       Extrato  aquoso   Planta   CIM     CBM       CIM   CBM  (mg/mL)   Alecrim  (Rosmarinus  officinalis  L.)    1,25   2,5          5,0   >20     Gengibre  (Zingiber  officinale)    1,25   5,0         20      >20     Para  o  S.  aureus  utilizando  o  extrato  aquoso  de  alecrim,  obteve-­se  (Tabela  5),   uma  CIM  e  CBM  de  5,0  mg/mL,  enquanto  o  extrato  aquoso  de  gengibre  uma  CIM  e   CBM   de   20  mg/mL.   Para   o   óleo   essencial   de   alecrim   constatou-­se   uma   CIM   de   0,625  mg/mL   e   CBM   de   1,25  mg/mL,   enquanto   o   óleo   de   gengibre   uma   CIM   de   1,25  mg/mL  e  CBM  de  2,5  mg/mL.  A  partir  destes  resultados  pode-­se  dizer  que  os   mesmos   demonstram-­se   promissores   em   relação   a   ação   bactericida   e   bacteriostática,   tendo   como   destaque   o   alecrim,   pois   este   demonstrou-­se   mais   efetivo  em  sua  ação  inibitória  e  bactericida,  e  também  pode-­se  constatar  analisando   as  Tabelas  4  e  5  que  o  S.  aureus  apresentou-­se  mais  sensível  a  ação  bactericida   dos  óleos  do  que  a  E.  coli.     54   Tabela  5  -­  Resultados  da  Concentração  Inibitória  Mínima  (CIM)  e  Concentração   Bactericida  Mínima  (CBM)  frente  S.  aureus  do  alecrim  e  do  gengibre     Óleo  essencial       Extrato  aquoso   Planta   CIM     CBM       CIM   CBM  (mg/mL)   Alecrim  (Rosmarinus  officinalis  L.)    0,625   1,25          5,0   5,0   Gengibre  (Zingiber  officinale)    1,25   2,5        20      20     De   acordo   com  Pesavento   et   al.   (2015),  Rosmarinus   foi  mais   eficaz   contra   bactérias  Gram-­negativas  em  concentrações  mais  baixas  25%  do  que  as  bactérias   Gram-­positivas,  50-­75%  do  óleo.   A   parede   celular   bacteriana   é   uma   estrutura   complexa,   semirrígida,   responsável   pela   forma   da   célula,   circundando   a   frágil   membrana   citoplasmática,   protegendo-­a  e  ao   interior  da  célula  das  alterações  adversas  no  ambiente  externo.   Bactérias   Gram-­negativas   apresentam   uma   membrana   externa,   constituída   de   lipopolissacarídeos,   lipoproteínas   e   fosfolipídeos   que   compreende   importante   fator   de   evasão   da   fagocitose   e   ações   do   complemento,   com   caráter   hidrofóbico   (TORTORA,  2012).  Já  as  bactérias  Gram-­positivas  apresentam  externo  à  membrana   citoplasmática,   parede   celular   com   presença   de   ácidos   teicóicos,   que   consistem   principalmente   de   um   álcool   e   fosfato,   configurando   alta   carga   negativa,   mais   propensa  a  ação  por  compostos  fenólicos  dos  óleos  essenciais.   Segundo   Burt   (2004)   o   óleo   de   alecrim   R.   officinalis   possui   em   sua   composição   elementos   majoritários   que   exercem   ação   bactericida,   tais   como   α-­ pineno,   bornil   acetato,   cânfora   e   1,8   cineol.   Sendo   que   no   estudo   em   questão   encontrou-­se  1,8-­cineol,  cânfora,  borneol  e  α-­terpineol.   Alimpic  et  al.  (2015)  realizaram  a  análise  de  microdiluição  em  poços,  do  óleo   essencial   de  Salvia   ringens   frente  a  alguns  microrganismos,   sendo  que  dois  deles   são   os   utilizados   neste   estudo,   onde   a  E.   coli   possui   o  mesmo   (ATCC   25922).   A   autora  testou  a  atividade  antibacteriana  do  óleo  em  seis  bactérias  Gram-­negativas  e   cinco  Gram-­positivas,  e  verificou  a  CIM  de  14,25  mg/mL  para  E.  coli   e  9,5  mg/mL   para   S.   aureus.   Também   constatou   que   as   estirpes   Gram-­positivas   foram   mais   sensíveis.  Ao  contrário  do  acima  mencionado,  Tzakou  et  al.  (2001)  descobriram  que   os   efeitos   inibitórios   do   óleo   de   S.   ringens   foi   mais   forte   contra   bactérias   Gram-­   55   negativas   e   atribuído   principalmente   à   presença   de   1,8-­cineol   como   componente   majoritário,  corroborando  assim  com  o  encontrado  para  alecrim  neste  estudo.     Tepe  et   al.   (2004)  utilizaram  o  óleo  de  S.  multicaulis,   utilizando  as  mesmas   cepas  do  autor  anterior,  onde  encontrou  uma  MIC  para  S.  aureus  de  36  mg/mL  e  72   mg/mL  para  E.  coli.   Celyktas   et   al.   (2007)   testaram   a   capacidade   antibacteriana   do   óleo   de   alecrim,   onde   as   amostras   foram   coletadas   de   três   regiões   diferentes   em   quatro   épocas   do   ano,   sobre   nove   microrganismos,   sendo   que   um   deles   foi   S.   aureus   (ATCC  6538P)  com  resultados  encontrados  de  CIM  que  variaram  de  5,0  mg/mL  até   20  mg/mL,  e  CBM  de  10  mg/mL  até  >20  mg/mL,  e  um  outro  microrganismo  foi  a  E.   coli  com  resultados  de  CIM  e  CBM  de  10  mg/mL  até  >20  mg/mL.  No  estudo  não  foi   possível  relacionar  os  constituintes  majoritários  1,8-­cineol  (61,4%)  e  cânfora  (24,1%)   com  a  atividade  antimicrobiana     Okoh,   Sadimenko   e   Afolayan   (2010)   estudaram   a   ação   do   óleo   de   alecrim   contra  S.   aureus   e  E.   coli.   O   resultado   encontrado   para   a   CIM   foi   de   3,75   e   7,5   mg/mL   e   CBM   de   7,5   e   >7,5   mg/mL   respectivamente.   Os   resultados   destes   experimentos   foram   bem   maiore