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CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIVATES
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA
INVESTIGAÇÃO DO PAPEL DA INTERAÇAO DOS GENES PRNP-
NCAM1 NOS TRANSTORNOS POR USO DE SUBSTÂNCIAS E NO
TRANSTORNO DE DÉFICIT DE ATENÇÃO/ HIPERATIVIDADE
Pricila Girardi
Lajeado, fevereiro de 2016
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Pricila Girardi
INVESTIGAÇÃO DO PAPEL DA INTERAÇAO DOS GENES PRNP-
NCAM1 NOS TRANSTORNOS POR USO DE SUBSTÂNCIAS E NO
TRANSTORNO DE DÉFICIT DE ATENÇÃO/ HIPERATIVIDADE
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biotecnologia, do
Centro Universitário UNIVATES, como
parte da exigência para a obtenção do
grau de Mestre em Biotecnologia, na área
de concentração Biotecnologia em Saúde.
Orientadora: Profª Dra. Verônica Contini
Coorientadora: Profª Dra. Júlia Pasqualini
Genro
Lajeado, fevereiro de 2016
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APOIO FINANCEIRO
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES): Programa
de Suporte à Pós-Graduação de Instituições de Ensino Particulares (PROSUP) e
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq): Edital
MCTI/CNPq 2013 – Chamada Universal
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RESUMO
Introdução: O transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é uma
desordem comportamental comum em crianças e que pode persistir na idade adulta.
Ele caracteriza-se por sintomas persistentes de desatenção, hiperatividade e
impulsividade. Além disso, uma proporção significativa dos pacientes com TDAH
também apresenta outras comorbidades envolvidas, especialmente os transtorno por
uso de álcool e nicotina. Diversos estudos moleculares têm sido realizados na busca
pelos genes envolvidos com o TDAH e alguns estudos têm apontando que fatores
genéticos de susceptibilidade ao TDAH são também importantes na dependência de
álcool e no uso de nicotina. Objetivo: O objetivo deste estudo é investigar a
influência da interação dos polimorfismos rs1799990, no gene PRNP, e rs965560,
no gene NCAM1, no TDAH e nas dependências de álcool e nicotina. Metodologia:
As amostras foram compostas por pacientes com TDAH, 431 crianças e 535 adultos,
130 homens dependentes de álcool, 639 indivíduos adultos da população geral e 77
crianças controles. Os polimorfismos foram genotipadas através do sistema de
discriminação alélica TaqMan. As análises estatísticas envolveram o teste do qui-
quadrado, ANOVA e, para o teste da interação gene-gene sobre a susceptibilidade
aos transtornos, foram utilizados modelos lineares gerais. Resultados: Não foram
detectadas interações significativas entre os polimorfismos investigados sobre a
susceptibilidade ao TDAH e às dependências de álcool e nicotina. Foi observada
uma associação entre o alelo A do polimorfismo rs1799990 com o TDAH na infância
(p=0,04). Em adultos com TDAH, indivíduos heterozigotos AG apresentaram uma
maior frequência de transtorno opositor desafiante (TOD) (p=0,017), assim como
escores médios dos sintomas de TOD significativamente maiores (p=0,012), em
comparação aos indivíduos homozigotos GG. Não foram detectadas associações
significativas para o polimorfismo rs965560 com nenhuma das variáveis
investigadas. Conclusão: Nossos resultados indicam que o polimorfismo rs1799990
pode estar associado com o TDAH na infância e com a presença de TOD em adultos
com TDAH. Esses resultados, no entanto, são preliminares e não foram testados
para múltiplos testes.
Palavras chave: TDAH, PRNP, NCAM1, dependência de álcool e uso de nicotina.
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ABSTRACT
Introduction: Attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) is a common behavioral
disorder in children that can persist into adulthood. It characterized by persistent
symptoms of inattention, hyperactivity and impulsivity. Moreover, a significant
proportion of patients with ADHD present other comorbidities, especially alcohol
dependence and nicotine use. Several molecular studies have been employed in the
search for the genes involved in ADHD and some studies have pointed that
susceptibility genetic factors of ADHD are also important in alcohol dependence and
nicotine use. Objective: The objective of this study is to investigate the influence of
the interaction between the polymorphisms rs1799990, in the PRNP gene, and
rs965560, in the NCAM1 gene, on the susceptibility to ADHD and alcohol and
nicotine dependence. Methods: Samples were composed by patients with ADHD,
431 children and 535 adults, 130 alcohol dependent men, 639 adults from the
general population and 77 children controls. The polymorphisms were genotyped by
the TaqMan allelic discrimination system. The statistical analysis involved the chi-
square test, ANOVA and, for the gene-gene interaction tests, general linear models
were used. Results: There were no significant interactions between the
polymorphisms investigated on the susceptibility to ADHD and to alcohol and nicotine
dependences. An association between the A allele of rs1799990 polymorphism and
ADHD in childhood (p=0.04) was observed. In adults with ADHD, individuals
heterozygous AG had a higher frequency of oppositional defiant disorder (ODD)
(p=0.017) and higher mean scores of symptoms of ODD (p=0.012), when compared
to homozygous GG. No significant associations were found for the rs965560
polymorphism with the investigated variables. Conclusion: Our results indicate that
the polymorphism rs1799990 may be associated with ADHD in childhood and with
the presence of ODD in adults with ADHD. These results, however, are preliminary
and were not tested for multiple testing.
Keywords: ADHD, PRNP, NCAM1, alcohol and nicotine use.
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 7
2 OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 8
2.1 Objetivos específicos.......................................................................................... 9
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ............................................................................... 9
3.1Transtorno de déficit de atenção e hiperatividade ............................................ 9
3.2 Transtorno por uso de substâncias ................................................................. 15
3.3 Genética do TDAH ............................................................................................. 16
3.4 PRPN E NCAM1 ................................................................................................. 20
4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 23
4.1 Amostra .............................................................................................................. 23
4.1.1 Adultos com TDAH ........................................................................................ 23
4.1.2 Crianças com TDAH ....................................................................................... 24
4.1.3 Dependentes de Álcool .................................................................................. 24
4.1.4 População geral .............................................................................................. 24
4.1.5 Usuários de Nicotina ...................................................................................... 25
4.2 Métodos laboratoriais ....................................................................................... 25
4.3 Análises Estatísticas ......................................................................................... 25
5 RESULTADOS ....................................................................................................... 26
6 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 32
7 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 34
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 35
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INVESTIGAÇÃO DO PAPEL DA INTERAÇAO DOS GENES PRNP-
NCAM1 NOS TRANSTORNOS POR USO DE SUBSTÂNCIAS E NO
TRANSTORNO DE DÉFICIT DE ATENÇÃO/ HIPERATIVIDADE
1 INTRODUÇÃO
O transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é uma transtorno
do desenvolvimento neurológico comum no início da infância, que pode persistir em
adultos, sendo caracterizado por um quadro de desatenção, agitação motora e
impulsividade, que pode acarretar diversos prejuízos no desenvolvimento (APA,
2014). Os pacientes com TDAH, ao longo da vida, podem apresentar problemas de
aprendizagem, comportamento opositor, distúrbios de conduta, ansiedade e
depressão. Entre as comorbidades mais frequentes, destacam-se os transtornos por
uso de substâncias (TUS) (Rohde et al, 1999; Szobot e Bukstein, 2008).
Os TUS, geralmente, têm início na adolescência e são caracterizados por um
grupo de sintomas cognitivos, comportamentais e fisiológicos, que indicam um uso
contínuo de alguma substância psicoativa, apesar dos problemas relacionados ao
seu uso (APA, 2014). O TDAH na infância aumenta o risco de desenvolvimento de
TUS na vida adulta. Crianças com TDAH apresentam um risco 2,5 vezes maior de
desenvolver TUS do que outra criança sem o transtorno (Lee et. al, 2011).
Estudos em famílias e com gêmeos sugerem uma alta herdabilidade para o
TDAH, tornando-o um transtorno atrativo para estudos moleculares. Com base nos
possíveis efeitos patofisiológicos do TDAH, foram selecionados diversos genes
candidatos para o transtorno (Faraone et al, 2005; Gizer et al, 2009). Nesse sentido,
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muitos polimorfismos têm sido associados ao TDAH, em crianças e adultos,
incluindo vários marcadores no sistema adrenérgico e dopaminérgico, como o gene
da proteína transportadora de dopamina (SLC6A3/ DAT1), o gene do receptor D5 de
dopamina (DRD5), o gene do receptor D4 de dopamina (DRD4), o gene da proteína
transportadora de serotonina (SLC6A4), o gene da proteína associada ao
sinaptossoma de 25kDa (SNAP-25), o gene do receptor 1B de serotonina (HTR1B),
o gene latrofilina 3 (LPHN3) e o gene óxido nítrico sintase (NOS1), entre outros. No
entanto, apesar da quantidade de marcadores genéticos já associados ao TDAH
nenhum parece ser suficiente ou necessário para o desenvolvimento do transtorno,
indicando a necessidade da continuidade dos estudos moleculares (Hawi et al,
2015), especialmente considerando novas abordagens, como os estudos de
interação gene-gene (Rovaris et al. 2013).
O gene PRNP codifica uma glicoproteína de membrana, chamada PrPc.
Apesar de sua função fisiológica não estar completamente elucidada, existem
evidências que demonstram o seu envolvimento em diferentes processos fisiológicos
relacionados com sinalização celular, plasticidade neural, entre outros (Zomosa-
Signoret et al, 2008). É sugerido também que a interação com outros elementos
parece ser essencial para a função da PrPc (Martins e Brentani, 2002; Coitinho et al,
2007; Santos et. al, 2013) e, entre as proteínas que interagem diretamente com a
PrPc, destaca-se a NCAM, codificada pelo gene NCAM1. A NCAM é amplamente
expressa no sistema nervoso central, e tem sido associada a diversas funções
neurobiológicas (Kiss e Muller, 2001; Coitinho et al, 2007). É interessante ressaltar
que o gene NCAM1 está localizado em um cluster gênico na região cromossômica
11q23 e diversos estudos têm relacionado polimorfismos nessa região com
transtornos relacionados com o uso de substâncias (Yang et. al, 2008; Nelson et al,
2013). No entanto, apesar das evidências de interação entre as proteínas PrPc e
NCAM, possíveis efeitos epistáticos dos genes PRNP e NCAM1 na predisposição a
doenças complexas, especialmente o TDAH e aos TUS, ainda não foram
investigados.
2 OBJETIVO GERAL
Investigar a influência da interação dos polimorfismos rs1799990, no gene
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PRNP, e rs965560, no gene NCAM1, no TDAH e nas dependências de álcool e
nicotina.
2.1 Objetivos específicos:
- Determinar as frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo rs1799990, do
gene PRNP, nas amostras de pacientes com TDAH (adultos e crianças), de
indivíduos da população geral e de homens dependentes de álcool;
- Determinar as frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo rs965560, do
gene NCAM1, nas amostras de pacientes adultos com TDAH, de indivíduos da
população geral e de homens dependentes de álcool;
- Investigar a associação do polimorfismo rs1799990 com o TDAH e com as
dependências de álcool e nicotina;
- Investigar se existe um efeito diferencial do polimorfismo rs1799990 em crianças
com maior risco de desenvolvimento de TUS (presença de TDAH e transtorno de
conduta);
- Testar a interação entre os polimorfismos selecionados nos genes PRNP e NCAM1
sobre a susceptibilidade ao TDAH e às dependências de álcool e nicotina;
- Investigar se os efeitos principais dos polimorfismos rs1799990 e rs965560, ou da
interação, estão implicados em características clínicas dos pacientes com TDAH e
dos homens dependentes de álcool (dimensões de temperamento, presença de
comorbidades, sintomas de gravidade e parâmetros neuropsicológicos).
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Transtorno de déficit de atenção e hiperatividade
O TDAH é caracterizado por um quadro clínico de sintomas de desatenção,
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desenvolvimento inapropriado, aumento da impulsividade e hiperatividade, que
devem estar presentes em mais de um ambiente (APA, 2014). É um transtorno
considerado comum durante a infância, e que pode desencadear problemas
relacionados a dificuldades na aprendizagem, comportamentos antissociais e
prejuízos em relações interpessoais (Klein et al. 2012).
O Manual Diagnóstico e estatístico de Transtornos Mentais da Associação
Norte-Americana de Psiquiatria, 5ª edição (DSM-V), classifica os pacientes de
acordo com a gravidade dos sintomas de desatenção e hiperatividade/impulsividade,
em grau leve, moderado e grave. Na Tabela 1 encontram-se descritos os sintomas
utilizados para o diagnóstico de TDAH, de acordo com o DSM-V. Para uma criança
ser diagnosticada com TDAH, é preciso apresentar seis ou mais sintomas de pelo
menos um grupo do transtorno (hiperatividade/impulsividade ou desatenção), por
pelo menos seis meses, em um grau que é inconsistente com o nível de
desenvolvimento, e que tenha impacto negativo em atividades sociais e acadêmicas/
profissionais. Já para adultos, pelo menos cinco sintomas são necessários (APA,
2014).
Tabela 1: Critérios diagnósticos para o Transtorno de Déficit de Atenção/
Hiperatividade segundo o DSM-V (APA, 2014)
A. Padrão persistente de desatenção e/ou hiperatividade-impulsividade que interfere no
funcionamento e no desenvolvimento, caracterizado por (1) e/ou (2).
1. Desatenção: Seis (ou mais) dos seguintes sintomas persistem pelo menos seis meses em
um grau que é inconsistente com o nível de desenvolvimento e têm impacto negativo
diretamente nas atividades sociais, acadêmicas/profissionais.
a) Frequentemente não presta atenção em detalhes ou comete erros por descuido em tarefas
escolares, no trabalho ou durante outras atividades (p. ex., negligencia ou deixa passar
detalhes, o trabalho é impreciso).
b) Frequentemente tem dificuldades de manter a atenção em tarefas ou atividades lúdicas (p.
ex., dificuldade de manter foco em aulas, conversas ou leituras prolongadas).
c) Frequentemente parece não escutar quando alguém lhe dirige a palavra diretamente (p. ex.,
parece estar com a cabeça longe, mesmo na ausência de qualquer distração obvia).
d) Frequentemente não segue instruções até o fim e não consegue terminar trabalhos
escalares, tarefas ou deveres no local de trabalho (p. ex., começa as tarefas, mas
rapidamente perde o foco e facilmente perde o rumo).
e) Frequentemente tem dificuldades para organizar tarefas e atividades (p. ex., dificuldades em
gerenciar tarefas sequenciais; dificuldades de manter materiais e objetivos pessoais em
ordem; trabalho desorganizado e desleixado; mau gerenciamento do tempo; dificuldades de
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cumprir prazos).
f) Frequentemente evita, não gosta, ou reluta em se envolver em tarefas que exijam esforço
mental prolongado (p. ex., trabalhos escolares ou lições de casa; para adolescentes mais
velhos e adultos, preparo de relatórios, preenchimento de formulários, revisão de trabalhos
longos).
g) Frequentemente perde coisas necessárias para tarefas ou atividades (p. ex., materiais
escolares, lápis, livros, instrumentos, carteiras, chaves, documentos, óculos, celular).
h) Com frequência é facilmente distraído por estímulos externos (para adolescentes mais
velhos e adultos, pode incluir pensamentos não relacionados).
i) Com frequência é esquecido em atividades cotidianas (p. ex., realizar tarefas, obrigações;
para adolescentes mais velhos e adultos, retornar ligações, pagar contas, manter horários
agendados).
2. Hiperatividade e impulsividade: Seis (ou mais) dos seguintes sintomas persistem por pelo
menos seis meses em um grau que é inconsistente com o nível do desenvolvimento e tem
impacto negativo diretamente nas atividades sociais e acadêmicas/ profissionais.
a) Frequentemente remexe ou batuca as mãos ou os pés ou se contorce na cadeira.
b) Frequentemente levanta da cadeira em situações que se espera que permaneça sentado (p.
ex., sai do seu lugar em sala de aula, no escritório ou em outro local de trabalho ou em
outras situações que exija que se permaneça no mesmo lugar).
c) Frequentemente corre ou sobe nas coisas em situações que isso é inapropriado (em
adolescentes e adultos, pode se limitar a sensações de inquietude).
d) Com frequência é incapaz de brincar ou se envolver em atividades de lazer calmamente.
e) Com frequência “não para”, agindo como se estivesse “com o motor ligado” (p. ex., não
consegue ou se sente desconfortável em ficar parado por muito tempo, como em
restaurantes, reuniões, outros podem ver o indivíduo como inquieto ou difícil de
acompanhar).
f) Frequentemente fala demais.
g) Frequentemente deixa escapar uma resposta antes que a pergunta seja concluída (p. ex.,
termina as frases dos outros, não consegue aguardar a sua vez de falar).
h) Frequentemente tem dificuldades para esperar a sua vez (p. ex., aguardar em uma fila).
i) Frequentemente interrompe ou se interrompe (p. ex., mete-se nas conversas, jogos ou
atividades, pode começar a usar as coisas de outras pessoas sem pedir ou receber
permissão; para adolescentes e adultos, pode intrometer-se em ou assumir o controle sobre
o que outros estão fazendo).
B. Vários sintomas de desatenção ou hiperatividade-impulsividade estavam presentes antes dos 12
anos de idade.
C. Vários sintomas de desatenção ou hiperatividade-impulsividade estão presentes em 2 ou mais
ambientes (p. ex., em casa, na escola, no trabalho, com amigos ou parentes; em outras atividades).
D. Há evidencias claras que os sintomas interferem no funcionamento social, acadêmico ou
profissional, ou de que reduzem sua qualidade.
E. Os sintomas não ocorrem durante o curso de esquizofrenia ou outros transtorno psicótico e não
são mais bem explicados por outro transtorno mental (p. ex., transtorno de humor, transtorno de
ansiedade, transtorno dissociativo, transtorno de personalidade, intoxicação ou abstinência de
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substâncias).
Acreditava-se que o TDAH era um transtorno exclusivo de crianças e que se
resolvia com a idade, mas inúmeros estudos mostram que ele persiste na idade
adulta, porém com sintomas menos evidentes (Faraone et al., 2006). Os sintomas de
hiperatividade tendem a diminuir mais cedo, enquanto que os sintomas de
desatenção são mais persistentes (Swanson et al, 1998). Estima-se que 60 a 70%
das crianças com TDAH continuam com sintomas na vida adulta (Wender et. al,
2001). Outros estudos que analisaram a persistência do TDAH encontram valores
que variam de 58% a 80%, um valor bastante significativo (Biederman et al, 2000).
Atualmente, a prevalência estimada, em um estudo de meta-análise, para TDAH em
adultos é de 2,5% (Simon et al. 2009), enquanto que para crianças é de 5,29%
(Polanczyk et al, 2007).
Crianças com TDAH apresentam prejuízos em funções cognitivas e
executivas, como atenção, percepção, planejamento e organização (Swanson et. al,
1998). Na infância e na adolescência, o TDAH está associado com um risco
aumentado de baixo desempenho escolar, repetência, expulsões e suspensões
escolares, relações difíceis com familiares e colegas, desenvolvimento de
ansiedade, depressão, baixa autoestima, problemas de conduta e delinquência,
experimentação e abuso de drogas (Rohde e Halpen, 2004; Barkley et al, 2002). Na
idade adulta, o TDAH está associado com depressão, desemprego, crimes,
dificuldades financeiras, problemas interpessoais e diversas comorbidades, como o
aumento do risco de transtorno por uso de substâncias (Molina et al, 2009;
Biederman et al, 2006).
A neurofisiologia do TDAH é bastante complexa e ainda não totalmente
compreendida. Inicialmente, estudos com animais apontavam para uma teoria
dopaminérgica do TDAH, onde uma deficiência de dopamina nas regiões corticais e
do striatum seria responsável pela manifestação dos sintomas desse transtorno
(Levy, 1991; Arnsten, 2006). Com o avanço dos estudos, as funções noradrenérgicas
foram incluídas (Swanson et. al., 1998), principalmente porque as regiões ligadas ao
TDAH são ricas tanto em dopamina quanto em noradrenalina (Faraone e Biederman,
1998). Além disso, a eficácia clínica dos medicamentos estimulantes (como o
metilfenidato), que são usados no tratamento de TDAH, está relacionada com ambos
os sistemas, dopaminérgico e noradrenérgico (Barry et. al, 2007).
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Estudos de neuroimagem têm levado a avanços na compreensão dos
quadros clínicos do TDAH, e mostram um papel importante do cérebro para o
transtorno, em regiões que envolvem atenção, controles inibitórios e executivos
(Pasini e D’Agati, 2009). Um grupo de pesquisadores tem acompanhado o
desenvolvimento cerebral, através de estudos de neuroimagem, de crianças com
TDAH, e crianças com desenvolvimento típico, ao longo da adolescência e início da
vida adulta (Shaw et. al, 2007, 2011, 2013). Em um primeiro estudo, esses autores
compararam 824 imagens de ressonância magnética de cérebros de 223 crianças
com TDAH e 223 crianças sem a doença. Os resultados indicaram que o padrão de
desenvolvimento cerebral das crianças com TDAH era semelhante ao das crianças
sem a doença, porém o desenvolvimento diferiu no tempo (Shaw et. al, 2007). Em
um segundo estudo, utilizando a mesma abordagem e metodologia do estudo
anterior, os autores compararam o padrão de desenvolvimento cerebral de crianças
com TDAH e crianças sem a doença, porém desta vez com avaliação para sintomas
de hiperatividade e impulsividade. Os resultados desse estudo continuam apontando
um atraso maior na maturação do córtex das crianças com TDAH, porém também
indicam que as crianças sem o diagnóstico, mas com sintomas do transtorno,
exibem o mesmo padrão de atraso no desenvolvimento, que está relacionado com a
gravidade de sintomas de hiperatividade e impulsividade (Shaw et. al, 2011). Em
2013, o grupo reavaliou 92 indivíduos, agora no início da vida adulta, da amostra
inicial de crianças com TDAH. Destes, 37 (40%) mantiveram o diagnóstico e o
padrão de atraso no desenvolvimento cortical, quando comparados com o grupo de
remissão e também com um grupo de 184 adultos controles. Os pacientes que
apresentaram a remissão dos sintomas demonstraram uma convergência para as
dimensões cerebrais típicas, sugerindo que o TDAH na vida adulta está ligado a um
atraso persistente na trajetória de desenvolvimento cerebral, especialmente das
regiões corticais.
Mais recentemente, a patofisiologia do TDAH passou de modelos focados nas
regiões fronto estriadas para modelos de disfunção de redes cerebrais, onde os
estudos estão cada vez mais concentrados em anormalidades na conectividade do
cérebro (Cortese et al, 2013; Konrad, 2010). A Imagem por Tensor de Difusão (DTI) é
uma modalidade de ressonância magnética que fornece informações sobre a
direção e integridade de fibras neurais. Estudos utilizando DTI mostram mudanças
no desenvolvimento da substância branca em regiões pré-frontais, e em torno dos
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gânglios da base e do cerebelo, de pacientes com TDAH, o que gera uma
diminuição da mielinização de axônios. Acredita-se que estas alterações causam
uma diminuição da velocidade da comunicação neuronal (D’Agati et al, 2010).
Um estudo com crianças e adolescentes com TDAH também mostrou uma
diminuição na conectividade do cérebro nos lobos parietal, frontal e no córtex
estriado. Esta conectividade se normaliza na maioria dos casos com o uso de
metilfenidato (MPH) (Rubia et al, 2010). Outros estudos mostram diferenças na
maturação do córtex pré-frontal em pacientes com TDAH, se comparados com um
grupo controle. Quando ocorre a normalização do volume, ocorre uma melhora dos
sintomas. Já uma diferença progressiva do volume acarreta em uma persistência
dos sintomas. Acredita-se que esse padrão de desenvolvimento mais tardio em
algumas regiões cerebrais pode ajudar a compreender a heterogeneidade clinica do
transtorno (Paus, 2005; Konrad, 2010).
Fatores ambientais também são relevantes no transtorno, sendo importantes
para o funcionamento adaptativo e para a saúde da criança, como
desentendimentos familiares e presença de transtornos mentais nos pais, os quais
estão associados ao surgimento e manutenção desse transtorno (Faraone e
Biederman 1998). Adversidades sociais como divórcio, baixa renda, famílias
grandes, criminalidade dos pais, psicopatologia materna, complicações na gestação,
baixo peso ao nascer e má saúde materna, também já foram associadas com o
TDAH (Biederman et al, 1995, Faraone e Biederman, 1998). Da mesma forma, o uso
de álcool e nicotina pela mãe também é um fator de risco para o TDAH, sendo
sugerido que o tabagismo materno aumenta 2,7 vezes o risco do transtorno (Mick et
al, 2002; Milberger et. al, 1996), que parece estar relacionado a um efeito nos
receptores nicotínicos que modulam a atividade dopaminérgica (Weiss et al, 2007).
A heterogeneidade do TDAH é atribuída às múltiplas vias envolvidas no
desenvolvimento do transtorno, o caracterizando como multifatorial com base
neurológica, devido à interação de fatores ambientais e genéticos (Curatolo et al,
2010; Purper-Ouakil et al, 2011). A interação gene-ambiente pode ter um papel
importante na heterogeneidade do TDAH, por aumentar a variabilidade de fenótipos
(Coghill, 2009). Acredita-se que ela pode se dar por dois modos: o fator genético
pode diminuir ou aumentar o impacto de um ambiente em particular, ou um fator
ambiental pode ativar um efeito genético (Purper-Ouakil et al, 2011).
15
3.2 Transtornos por uso de substâncias
Crianças e adolescentes com TDAH têm um risco aumentado e um início
precoce de TUS, incluindo o consumo de cigarro (Zulauf et al, 2014). Geralmente, os
TUS começam na adolescência ou no início da idade adulta, sendo que cerca de
8,9% dos adolescentes manifestam transtornos por uso de drogas e cerca de 6,4%
transtorno por uso de álcool (Merikangas et al, 2010). Um estudo longitudinal
mostrou que crianças com TDAH têm duas vezes mais propensão ao uso de nicotina
na vida, são três vezes mais propensas à dependência de nicotina na adolescência
e, na vida adulta, são duas vezes mais propensas ao uso e dependência de álcool,
aproximadamente 1,5 vezes mais propensas ao uso de maconha e duas vezes mais
propensas ao uso de cocaína. Em geral, uma criança com TDAH tem 2,5 vezes mais
risco de desenvolver TUS de forma global do que uma criança sem TDAH (Lee et.
al, 2011).
Existem várias teorias para explicar essa relação entre os TUS e o TDAH;
uma delas leva em conta que crianças e adolescentes com TDAH têm maior evasão
escolar que aqueles sem TDAH (Barbaresi et al, 2007; Bussing et al, 2010). As
dificuldades escolares podem levar ao uso de substâncias como meio de mascarar
essa realidade (Fletcher et al, 2009). Outra preocupação é que o início precoce do
uso de medicamentos estimulantes na infância possa estar ligado a esse aumento
do risco de TUS em pacientes com TDAH. No entanto, segundo Biederman et al.
(2009), o tratamento farmacológico adequado do TDAH reduz o risco de TUS em
jovens com TDAH.
Outra teoria se baseia nos medicamentos usados para o tratamento de TDAH.
O principal fármaco utilizado é o metilfenidato, que possui eficácia comprovada
(Atkinson et al, 2010) e age no sistema nervoso central (SNC), aumentando a
quantidade de dopamina disponível (Ogdie et al, 2003). O uso de drogas de abuso,
incluindo, cocaína, anfetamina, meta-anfetamina, ecstasy, nicotina, álcool, opiaceos
e maconha, aumentam as concentrações sinápticas de dopamina, mais nitidamente
no centro cerebral de recompensa, o núcleo de accumbens (Cavacuiti, 2011). De
acordo com essa hipótese, indivíduos com TDAH podem usar substâncias
estimulantes para aumentar as concentrações de dopamina como uma forma de
automedicação (Wilens et al, 2007). Nesse sentido, o TDAH também pode estar
ligado à desmoralização social e ao fracasso, que podem estar presentes em
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pessoas com TUS também, e a automedicação pode ser uma forma de atenuar os
sintomas de humor e insônia (Biederman et al, 2006).
Um precursor importante para o desenvolvimento de TUS é o tabagismo na
adolescência, sendo que metade dos fumantes jovens desenvolvem TUS na idade
adulta (Biederman et al, 2006). Adultos dependentes de nicotina apresentam uma
melhora nos sintomas de atenção e funcionamento cognitivo, o que fez com que
várias pesquisas utilizassem agentes nicotínicas para tratamento de TDAH (Cunha
et al, 2008; Rivera-Oliver e Díaz-Ríos, 2014). Em indivíduos com TDAH têm sido
sugerida uma correlação entre o número de sintomas de desatenção e
hiperatividade/ impulsividade e o desenvolvimento de TUS (Gudjonsson et al, 2012).
Um estudo de coorte longitudinal com crianças canadenses realizado por Pingault et
al. (2012) constatou que os sintomas de desatenção estavam associados à
dependência de nicotina, enquanto que os sintomas de hiperatividade não estavam.
Outra hipótese proposta para explicar a relação entre o TDAH e os TUS é o
modelo da desinibição comportamental, que é caracterizado por um déficit na
capacidade de inibir ações que visam a gratificação imediata, mesmo que estas
possam ser socialmente inadequadas e possam resultar em consequências
negativas a médio e longo prazo (Young et. al., 2009). Nesse contexto, o TUS seria
uma consequência de uma cascata de desinibição comportamental que tem início na
infância e engloba traços específicos de personalidade, como extroversão,
impulsividade e busca de novidades, e alguns transtornos, como o TDAH, o
transtorno de conduta (TC) e o transtorno opositor desafiante (TOD). Fatores de
risco comuns, tanto genéticos como ambientais, seriam responsáveis por esse
conjunto comportamental. Ao longo do desenvolvimento, novos fatores poderiam
modelar a expressão desses fenótipos, o que explicaria por que, mesmo dentro de
uma via de susceptibilidade comum, nem todos os indivíduos vulneráveis
apresentam o mesmo desfecho (Iacono et al. 2008).
3.3 Genética do TDAH
Os estudos familiares, incluindo estudos com gêmeos e adotados, sugerem
que existe alta agregação familiar no TDAH. O risco para doença é de 2 a 8 vezes
17
maior nos pais e irmãos das crianças afetadas, do que na população em geral
(Faraone e Doyle, 2001). Nesse sentido, os estudos com adotados são importantes
para desvincular os fatores genéticos do ambiente compartilhado e, num estudo com
adotivos, Cantwell (1975) mostrou que pais biológicos de crianças hiperativas têm
alto risco de TDAH, se comparados aos pais adotivos.
Os estudos com gêmeos também demonstraram que existe uma alta
herdabilidade para o TDAH, sendo esta estimada em 76% em crianças (Faraone et
al, 2005), e, em adultos, quando são usadas escalas de auto avaliação, em
aproximadamente 30% (Boomsma et al, 2010). Alguns autores têm atribuído essa
discrepância de valores à dificuldade de avaliação para o TDAH em adultos, visto
que muitos diagnósticos na vida adulta são feitos utilizando escalas de auto
avaliação, que podem gerar resultados não tão precisos, por dependerem da
memória dos pacientes (Franke et al. 2012). Mais recentemente, no estudo de
Brikeel et al. (2015) foram avaliados diferentes métodos de cálculo de herdabilidade
em adultos e chegou-se em um valor de herdabilidade que varia entre 70 e 80%, ao
combinar a avaliação dos pais com a auto avaliação, fornecendo evidências de que
a herdabilidade na vida adulta é a mesma que na infância.
Com base na descoberta da grande relevância da genética no TDAH, ele
tornou-se um alvo atrativo para estudos genéticos e várias ferramentas moleculares,
como estudos de ligação, estudos com genes candidatos e, mais recentemente,
estudos de associação genômica (GWAS) são utilizados na busca dos possíveis
genes, ou variantes genéticas, que possam estar envolvidos com o desenvolvimento
do transtorno. Primeiramente, a partir dos genes e regiões sugeridas, e de hipóteses
biológicas prováveis, foram selecionados genes candidatos, sendo as anomalias na
neurotransmissão um dos primeiros caminhos a serem seguidos, pois medicamentos
usados para o TDAH aumentam as quantidades de dopamina e outros
neurotransmissores no cérebro (Ogdie et al, 2003).
O MPH, principal tratamento para TDAH, age na proteína transportadora de
dopamina (DAT) e um polimorfismo do tipo VNTR (número variável de repetições em
tandem), no gene que codifica essa proteína (SLC6A3/ DAT1), foi uma das primeiras
variantes estudadas, apresentando evidências de associação com o TDAH em
vários estudos (Faraone e Mick, 2010). Ainda no sistema dopaminérgico, o gene
codificador do receptor de dopamina D4 (DRD4) também tem sido implicado no
TDAH. Faraone et. al. (2005), em uma meta-análise, observaram uma associação
18
entre o alelo de sete repetições do VNTR de 48 pares de base (pb) no exon III do
gene DRD4 com o TDAH, em estudos familiares e de caso-controle.
Nos estudos com genes candidatos também foram identificadas variáveis de
risco nos genes do receptor D5 (DRD5), da proteína transportadora de serotonina
(SLC6A4/ 5-HTT), do receptor 1B de serotonina (HTR1B), da proteína associada ao
sinaptossoma de 25 kDa (SNAP25) e da Catechol-O-methyl-transferase (COMT),
(Gizer et al, 2009; Faraone e Mick, 2010; Stergiakouli e Thapar, 2010; Purper-Ouakil
et al., 2011). Muitos estudos com as mesmas variantes não encontraram associação
com o TDAH (Johansson et al, 2008; de Silva et al, 2011; Muller et. al, 2010), o que
ressalta a importância da realização de mais estudos para melhor compreender tais
achados.
Na revisão realizada por Hawi et al (2015) são descritos os principais genes
candidatos para o TDAH nos últimos 20 anos, como o SLC6A3, DRD4, DRD5,
SLC6A4, HTR1B, SNAP-25, o gene latrofilina 3 (LPHN3) e o gene óxido nítrico
sintase (NOS1). A Tabela 2 retirada deste artigo apresenta os principais genes
candidatos, investigados em estudos de ligação ou associação, e inclui as
referências que confirmam a associação dos mesmos com o transtorno.
Tabela 2 - Os genes candidatos que apresentam evidências de associação com
TDAH.
Gene Variante Localização Função Biológica Referências
SLC6A3 40 bp VNTR 3’ UTR
Regulador da dopamina extracelular e
mediador da recaptação de dopamina na
sinapse.
Cook et. al, 1995
Gizer et. al, 2009
DRD4 48 bp VNTR Exon
GPCR ativado pelo neurotransmissor
dopamina.
La Hoste et al, 1996
Gizer et. al, 2009
DRD5
148 pb
repetição de
dinucleotídeos
5’ flanking
Transdução de sinais extracelulares, sob a
forma de dopamina em várias respostas
intracelulares, incluindo efeitos no
adenilato ciclase, nos níveis de Ca2+ e na
condutividade do K+.
Daly et. al, 1999
Gizer et. al, 2009
SLC6A4 40 pb in/del 5’ flanking
Um membro da família dos
transportadores de membrana que são
dependentes de Na+ e Cl. Mediador da
receptação de serotonina na sinapse.
Manor et. al, 2002
Gizer et. al, 2009
HTR1B rs6296 Exon 1
GPCR para serotonina. O primeiro alvo
para antidepressivos e substância
psicoativas.
Hawi et al, 2002
Gizer et. al, 2009
SNAP25 rs3746544 3’ UTR
Proteína da membrana plasmática
essencial para a função da vesícula
sináptica e liberação do neurotransmissor.
Brophy et. al, 2002
Gizer et. al, 2009
SLC9A9
Inversão do
ponto de
parada
Região
3p14-q21
Um membro da grande família 9 de
carregadores de soluto. Ação na troca
eletroneural de H/Na+ através das
membranas.
de Silva et al, 2003
Lasky-Su et al, 2008
Mick et al, 2010
LPHN3 Haplótipos Exon 4-19 Codifica um membro da subfamília Arcos-burgos et al,
19
englobando
variantes em
exons
latrophilina de GPCR. Pode atuar na
transdução de sinal e na adesão celular.
2010, Ribases et al,
2011
GIT1 rs550818 Intron
GPCR quinase. Pode estar envolvida no
trafico de vesículas, adesão celular e
aumento da velocidade de migração de
células. Maior expressão do GIT1 é
conhecido por regular os receptores Beta 2
adrenérgicos.
Won et al, 2011
NOS1
180-210 bp CA
repetidos
Exon
Mediador de vários processos biológicos
incluindo neurotransmissão e é associado
com condições neurodegenerativas.
Reif et al, 2009
Franke et al, 2009
Abreviaturas: GPCR, Receptores acoplados a proteína G; UTR, região não traduzida; VNTR, número variável de
repetições em tandem.
Fonte: Hawi et al, 2015
Estudos de GWAS podem identificar variantes comuns que aumentam o risco
para determinada doença, utilizando genotipagens em larga escala. Os GWAS de
pacientes com TDAH já identificaram vários potencias genes de risco e têm revelado
algumas sobreposições de resultados, principalmente no lócus contendo o gene da
caderina 13 (CDH13) (Lesch et al, 2008). O gene CDH13 codifica uma molécula de
adesão celular que também é reguladora do crescimento das células neuronais
(Stergiakouli e Thapar, 2010). Vários resultados fornecem um efeito comum para
genes que codificam células de adesão (como o CDH13), reguladores de
plasticidade sináptica (ex. alfa catemina 2 – CTNNA2) e canais iônicos ou proteínas
relacionadas (ex. canais de cálcio dependentes de tensão e a dipeptil-peptidase 6 –
DPP6). No entanto, apesar da alta herdabilidade do transtorno e de todos os genes
já relacionados ao TDAH, nenhum dos genes investigados até o momento parece
ser suficiente ou necessário para o desenvolvimento do transtorno. Além disso,
parece que variantes genéticas comuns sozinhas, mesmo que tenham um efeito na
doença, ainda não são capazes de explicar toda a variância do fenótipo atribuível
aos genes.
Uma possível razão para a falta de sucesso de muitos estudos genéticos em
doenças complexas é a existência de interação entre lócus. Se um fator genético
funcional, principalmente em doenças genéticas, envolve vários outros genes e,
possivelmente, fatores ambientais, seu efeito potencial pode ser disperso quando ele
for analisado isoladamente. Por isso, muitos métodos estatísticos e softwares foram
criados para testar essas interações entre lócus em estudos de associação (Cordell,
2009).
Hipóteses de interações gene-gene baseadas em evidências biológicas
20
podem ser oriundas de estudos experimentais in vivo, in vitro ou também de análises
de bioinformática com foco na interface de interações proteína-proteína. Mota et. al.
(2013), baseados na hipótese de formação de heterodímeros entre os receptores de
dopamina D2 (DRD2) e D4 (DRD4) (Borroto-Escuela et. al, 2011; Gonzalez et. al,
2012), demonstraram, em duas amostras independentes, um efeito epistático de
variantes comuns nos genes DRD2 e DRD4 na susceptibilidade à dependência de
álcool, o que está provavelmente refletindo os diferentes padrões de
heteromerização propostos. É importante ressaltar que muitos resultados
controversos de associações entre os genes dos receptores de dopamina (DRD2 e
DRD4) e à dependência de álcool têm sido publicados. Os achados de Mota et. al.,
2013, portanto, abrem uma nova perspectiva de investigação e/ ou reavaliação do
papel desses genes nos transtornos psiquiátricos. Ainda nessa linha de investigação,
nosso grupo também detectou uma interação significa entre polimorfismos funcionais
nos genes do receptor mineralocorticoide (NR3C2) e do receptor glicocorticoide
(NR3C1) na susceptibilidade à dependência de nicotina (Rovaris et. al., 2013b). A
hipótese de um efeito epistático dos genes NR3C2 e NR3C1 foi baseada em
padrões de heterodimerização desses receptores sobre a regulação do eixo
hipotálamo-hipófise-adrenal, o qual pode estar envolvido, a partir de mecanismos
relacionados com o estresse, em diferentes aspectos do uso de tabaco. Em
conjunto, esses estudos de interações baseados em hipóteses biológicas (Borroto-
Escuela et al., 2011; Gonzalez et. al., 2012; Mota et. al., 2013; Rovaris et. al., 2013b)
sugerem um modo promissor de investigação do papel de variantes genéticas
comuns na susceptibilidade a doenças complexas.
3.4 PRNP E NCAM1
O gene PRNP codifica uma glicoproteína de membrana chamada de Proteína
Prion Celular (PrPC), encontrada nos terminais sinápticos de diversas áreas do
sistema nervoso central (Salès et. al, 1998). Embora a função fisiológica da proteína
PrPC não esteja completamente elucidada, sabe-se que isoformas alteradas dessa
proteína se depositam no cérebro. Mutações no gene PNRP são responsáveis por
uma categoria de doenças neurodegenerativas, conhecidas como doenças priônicas
ou encefalopatias espongiformes, que acometem humanos e animais (Prusener,
21
1998).
Diversos estudos têm demonstrado que a função da proteína PrPc, e de suas
interações com outros elementos, parece ser essencial para muitos fenômenos
biológicos relacionados com a sinalização celular, plasticidade neural e consolidação
da memória, entre outros, sugerindo um efeito em processos cognitivos (Zomosa-
Signoret et al, 2008). Além disso, existem evidências recentes demonstrando que
manipulações genéticas no gene PRNP modulam os efeitos do álcool em
camundongos, tanto via sinalização glutamatérgica (Petit-Paitel et al, 2012) quanto
via sinalização dopaminérgica (Rial et al, 2012).
O gene PRNP está localizado no braço curto cromossomo 20 e é composto
por dois éxons, que são traduzidos em uma longa sequência de 253 aminoácidos
(Prusener, 1998). Esse gene contém um polimorfismo comum no códon 129
(rs1799990), o qual pode codificar uma metionina (Met) ou uma valina (Val) nessa
posição. Evidências sugerem que este polimorfismo altera a conformação da
proteína e modula o risco de desenvolvimento das doenças priônicas (Petchanikow
et al, 2001; Tahiri-Alaoui et al, 2004). De fato, alguns estudos têm também
investigado associações entre esse polimorfismo e transtornos mentais, como a
esquizofrenia e doença de Alzheimer, além de medidas neuropsicológicas e memória
de longa duração (Papassotiropoulos et al, 2005; Martorell et al, 2007; Choi et al,
2010; Flirski et al, 2012). No entanto, os resultados são ainda pouco conclusivos.
O gene NCAM1 está localizado no cromossomo 11q23.1, e codifica a proteína
NCAM (neural cell adhesion molecule), a qual faz parte da superfamília de genes de
imunoglobulina, e é amplamente expressa no SNC. O NCAM1 é expresso em
células e neurônios que promovem a adesão e migração celular, a plasticidade
sináptica, o crescimento, proliferação, diferenciação e sobrevivência de neuritos
(Maness, Schachner 2007), tendo também um importante papel regulatório durante
o desenvolvimento do córtex pré-frontal (Cox et al. 2009).
Alguns estudos encontraram associações de variantes no gene NCAM1 com
transtornos mentais, como a esquizofrenia, autismo e o transtorno do humor bipolar,
o que sugere que o gene pode ter múltiplos efeitos (Arai et al. 2004; Lewis et al,
2003; Vawter, 2000). Camundongos knockout para o gene NCAM1 já foram usados
para imitar sintomas de esquizofrenia (Wood et al, 2001) e outros estudos
mostraram que esses modelos animais NCAM1 apresentaram comportamentos de
hiperatividade, agressividade, inquietação e comportamento social anormal (Stork et
22
al, 2000). Já em humanos, alterações nesse gene também estão ligadas a defeitos
no tubo neural (Deak et al, 2005).
É interessante ressaltar ainda que o gene NCAM1 está localizado em um
cluster gênico na região cromossômica 11q, juntamente com os genes TTC12
(tetratricopeptide repeat domain 12), ANKK1 (ankyrin repeat and kinase domain
containing 1) e DRD2, e muitos estudos têm relacionado polimorfismos nesses
genes com diversos comportamentos em humanos, especialmente com o uso de
substâncias. Haplótipos dessa região já foram associados com o uso de nicotina,
dependência de álcool e de drogas (Yang et al, 2008; Gelernter et al, 2006; Nelson
et al, 2013). Com relação ao TDAH, alguns autores têm demonstrado que a
interação entre variantes dessa região com variantes do gene LPHN3 aumenta o
risco de desenvolvimento do transtorno (Acosta et al. 2011; Jain et al. 2012; Bruxel
et al. 2015). Em um estudo do nosso grupo, publicado por Mota et al. (2015),
polimorfismos do cluster gênico NCAM1-TTC12-ANKK1-DRD2 foram associados
com a presença de comorbidades (transtorno depressivo maior e transtorno de
ansiedade generalizado) e com dimensões de temperamento (persistência e
evitação de danos), na amostra de pacientes adultos com TDAH, sugerindo que
essa variantes podem também contribuir para a heterogeneidade clínica observado
no transtorno.
Em conjunto, os trabalhos descritos acima sugerem que interações
envolvendo o gene NCAM1 podem contribuir para o desenvolvimento e/ou
heterogeneidade clínica do TDAH. Desta forma, considerando as evidências que
sugerem que o envolvimento da proteína PrPc em diferentes processos fisiológicos
depende de sua interação com outros elementos (Martins e Brentani, 2002; Coitinho
et al, 2007; Santos et. al, 2013) e que, entre as proteínas que interagem diretamente
com a PrPc, destaca-se a NCAM (Schmitt-Ulms et al, 2001), este estudo tem como
objetivo principal avaliar possíveis efeitos epistáticos dos genes PRNP e NCAM1 na
predisposição ao TDAH e aos TUS.
23
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Amostras
As amostras, descritas a seguir, de indivíduos adultos foram cedidas, para a
realização desse projeto, pelo professor Claiton Henrique Dotto Bau – coordenador
principal do grupo de pesquisa em genética psiquiátrica de adultos da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). A amostra referente às crianças foi cedida
pelos professores Mara Helena Hutz e Luis Augusto Rohde, coordenadores do grupo
de pesquisa em TDAH na infância da UFRGS. Todos os indivíduos estudados
assinam termos de consentimento, aprovados pelo comitê de ética em pesquisa do
Hospital de Clínicas de Porto Alegre, onde as amostras foram coletadas. No caso
das crianças, um termo de consentimento foi assinado por todos os pais e, para
cada criança ou adolescente, foi solicitada uma aprovação verbal.
4.1.1 Adultos com TDAH
A amostra foi composta por 535 indivíduos euro descedentes, de ambos os
sexos, diagnosticados no Programa de Transtorno de Déficit de
Atenção/Hiperatividade (ProDAH) do HCPA. Os pacientes preencheram os critérios
de diagnóstico do DSM-IV (APA, 1994) e foram avaliados em relação à gravidade
dos sintomas de TDAH.
O protocolo de pesquisa também incluiu uma avaliação de dados sócios
demográficos, diagnósticos quanto à presença de comorbidades psiquiátricas,
avaliações neuropsicológicas e de dimensões de temperamento. Todas as
avaliações foram realizadas por psiquiatras e psicólogos com experiência clínica em
TDAH e domínio dos instrumentos utilizados na rotina do ProDAH. Uma melhor
caracterização dos instrumentos clínicos utilizados pode ser encontrada em descrita
em Cerqueira et al. (2010) e Silva et al. (2014).
24
4.1.2 Crianças com TDAH
A amostra foi composta por 431 crianças com TDAH e 77 crianças controles,
de ambos os sexos, avaliados por psiquiatras da infância do ProDAH do HCPA. O
diagnóstico dos pacientes foi realizado de acordo com os critérios do DSM-IV (APA,
1994).
O protocolo de pesquisa também incluiu avaliação de dados sócios
demográficos, diagnósticos quanto à presença de comorbidades psiquiátricas e
avaliações neuropsicológicas dos pacientes. Maiores detalhes podem ser
encontrados em Roman et al. (2001), Schmitz et al. (2006) e Bruxel et al. (2015).
4.1.3 Dependentes de álcool
A amostra foi composta por 126 homens, maiores de 18 anos, dependentes
de álcool, diagnosticados durante o período de internação no Hospital Espírita de
Porto Alegre. O processo de diagnóstico seguiu os critérios do DSM-III. Além disso,
uma avaliação estruturada para genética no alcoolismo (Structured Assessment for
the Genetics in Alcoholism – SSAGA; Bucholz et al, 1994) foi empregada para
avaliar a gravidade dos sintomas e o perfil de comorbidades. Uma descrição mais
detalhada da amostra pode ser encontrada em Contini et al. (2006).
4.1.4 População geral
A amostra foi composta por 639 indivíduos, maiores de 18 anos, de ambos os
sexos, recrutados no banco de sangue do HCPA. O TDAH foi avaliado pela ASRS
(Adult ADHD Self-Report Scale screener), enquanto que outros transtornos
psiquiátricos foram diagnosticados a partir de um módulo de screening do SCID-I
(Structured Clinical Interview for DSM-IV). Essa amostra foi coletada para servir de
grupo controle nos estudos de genética do TDAH em adultos e do alcoolismo
(excluindo abusadores e dependentes de álcool). Maiores detalhes em Kortmann et
al. (2013).
25
4.1.5 Usuários de nicotina
A amostra foi formada por 463 indivíduos usuários de nicotina das amostras
descritas nos itens anteriores, com exceção das crianças, que foram avaliados a
partir de um questionário de tolerância (Fagerström Test for Nicotine Dependence -
FTND). O critério para tabagismo lifetime foi definido como o uso diário de cigarros
de tabaco, no presente ou no passado, por no mínimo 30 dias, já que o tabagismo
diário é fortemente correlacionado com a dependência de nicotina (Mayhew et.al.
2000; Wellman et.al. 2004; Polina et.al. 2009).
4.2 Métodos laboratoriais
Os polimorfismos analisados foram o rs1799990, no gene PRNP, e o
rs965560, no gene NCAM1. As amostras de DNA dos participantes, já armazenadas,
foram amplificadas e genotipadas pela técnica de reação em cadeia da polimerase
(PCR) através do sistema de discriminação alélica TaqMan® (Applied Byosistems).
O protocolo de genotipagem seguiu as recomendações do fabricante (assay-code:
C_2969398_10 para o rs1799990 e C_ 8909661_10 para o rs965560).
4.3 Análises estatísticas
O equilíbrio de Hardy-Weinberg e as associações entre os genótipos dos
polimorfismos com as variáveis categóricas foram testadas pelo teste do qui-
quadrado de Pearson. As comparações das variáveis clínicas contínuas entre os
diferentes genótipos foram realizadas através de ANOVA. As interações gene-gene
sobre a susceptibilidade ao TDAH e às dependências de álcool e nicotina foram
testadas por modelos lineares gerais.
26
5 RESULTADOS
A amostra de adultos com TDAH foi composta por 535 indivíduos, com uma
média de idade de 33,6 anos, sendo 55,7% do sexo masculino. A gravidade média
dos sintomas, avaliados pela escala SNAP-IV, foi de 1,88 (±0,55) para os sintomas
de desatenção, 1,45 (±0,78) para os sintomas de hiperatividade e 1,55 (±0,87) para
os sintomas de impulsividade. A amostra apresentou um escore de QI médio
estimado de 102 (±9,33) e 7,9% dos pacientes apresentaram o diagnóstico de
dependência de álcool lifetime e 43,7% de uso de nicotina.
A amostra de crianças com TDAH foi composta por 431 indivíduos, com uma
média de idade de 10,4 anos (±3,14), sendo que 77,6% são meninos. O escore de
QI médio estimado para essa amostra foi de 92,2 (±13,6) e a gravidade média dos
sintomas, avaliados pela escala SNAP-IV, foi de 1,92 (±0,57) para os sintomas de
desatenção e 1,62 (±0,78) para os sintomas de hiperatividade.
As frequências alélicas e genotípicas para os polimorfismos rs1799990-PRNP
e rs965560-NCAM1 nas amostras de pacientes com TDAH, indivíduos controles e
de homens dependentes de álcool encontram-se descritas na tabela 3. As
frequências genotípicas para todas as amostras descritas estão de acordo com o
esperado para o equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Tabela 3: Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos rs1799990-PRNP e
rs965560-NCAM1 nas amostras investigadas
Variável Crianças
com TDAH
Crianças
sem TDAH
Adultos
com TDAH
Adultos da
população
geral
Homens
dependentes
de álcool
n= 431 n= 77 n= 535 n= 639 n= 130
rs1799990
AA 191 (44,3) 27 (35,1) 243 (45,4) 275 (43,0) 54 (41,6)
AG 181 (42,0) 33 (42,8) 235 (43,9) 292 (45,7) 58 (44,6)
GG 59 (13,7) 17 (22,1) 57 (10,7) 72 (11,3) 18 (13,8)
alelo A 0,65 0,56 0,67 0,66 0,64
alelo G 0,35 0,44 0,33 0,34 0,36
rs965560
AA 45 (10,4) 4 (5,2) 46 (8,6) 63 (9,8) 11 (8,5)
AG 180 (41,8) 35 (45,4) 240 (44,9) 265 (41,5) 44 (33,8)
GG 206 (47,8) 38 (49,4) 249 (46,5) 311 (48,7) 75 (57,7)
alelo A 0,31 0,28 0,31 0,31 0,25
alelo G 0,69 0,72 0,69 0,69 0,75
Abreviações: TDAH, Transtorno de déficit de atenção e hiperatividade.
As frequências genotípicas estão expressas como n e (%).
27
Não foram detectadas associações significativas entre o polimorfismo
rs1799990-PRNP com os TUS (dependência de álcool e uso de nicotina) e TDAH
em adultos. Foi observada uma associação entre o alelo A do polimorfismo com o
TDAH na infância (p=0,04). Essas análises estão descritas na tabela 4. Não foram
detectadas interações significativas entre os polimorfismos investigados sobre a
susceptibilidade ao TDAH, na infância (p=0,507) e na fase adulta (p=0,238), e às
dependências de álcool (p=0,276) e nicotina (p=0,07).
Tabela 4: Comparação entre as frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo
rs1799990-PRNP em indivíduos com TDAH e controles, em homens dependentes
de álcool e controles e em usuários de nicotina e controles.
Amostra Genótipos p Alelos P
AA AG GG A G
Adultos com TDAH (n=535) 243 (45,4) 235 (43,9) 57 (10,7) 0,710 0,67 0,33 0,47
Controles (n=639) 275 (43,0) 292 (45,7) 72 (11,3) 0,66 0,34
Crianças com TDAH (n=431) 191 (44,3) 181 (42,0) 59 (13,7) 0,112 0,65 0,35 0,04
Controles (n=77) 27 (35,1) 33 (42,9) 17 (22,1) 0,56 0,44
Crianças com TDAH + TC
(n=53)
22 (41,5) 22 (41,5) 9 (17,0) 0,760 0,62 0,38 0,55
Crianças apenas com TDAH
(n=378)
169 (44,7) 159 (42,1) 50 (13,2) 0,65 0,35
Homens dependentes de
álcool (n=130)
54 (41,5) 58 (44,6) 18 (13,8) 0,597 0,64 0,36 0,46
Controles homens (n=314) 138 (43,9) 143 (45,5) 33 (10,5) 0,67 0,33
Uso de nicotina (n=463) 191 (41,3) 219 (47,3) 53 (11,4) 0,322 0,65 0,35 0,27
Controles (n=845) 384 (45,4) 366 (43,3) 95 (11,2) 0,67 0,33
Abreviações: TDAH, Transtorno de déficit de atenção e hiperatividade; TC, transtorno de conduta.
As frequências genotípicas estão expressas como n e (%).
Na tabela 5 encontra-se uma descrição geral da amostra de adultos com
TDAH, categorizada de acordo com os genótipos para os dois polimorfismos
analisados. Os dados incluem principais comorbidades, escores de gravidade de
sintomas de TDAH, dimensões de temperamento e escores de desempenho
cognitivo. Não foram observadas associações significativas com o polimorfismo
rs965560-NCAM1. Com relação ao polimorfismo rs1799990-PRNP, podemos
destacar que indivíduos heterozigotos AG apresentaram uma maior frequência da
comorbidade TOD (p=0,017), assim como escores médios de sintomas de TOD
significativamente mais elevados (p=0,012), em comparação aos indivíduos
28
homozigotos GG. Para as demais variáveis investigadas, não foram detectadas
diferenças significativas entre os genótipos.
29
Tabela 5: Efeitos dos polimorfismos rs1799990 e rs965560 em características clínicas da amostra de pacientes adultos com TDAH
Característica PRNP-rs1799990 NCAM1-rs965560
Comorbidades AA n=243 AG n=235 GG n=57 p* GG n=249 AG n=240 AA n=46 p*
Diagnóstico TOD atual, n (%) 71 (31,8) 85 (39,4) 11 (20,0) 0,018a 78 (33,6) 75 (34,2) 14 (32,6) 0,974
Diagnóstico TOD lifetime, n (%) 141 (58,3) 151 (64,5) 32 (57,1) 0,311 149 (59,8) 148 (62,4) 27 (58,7) 0,799
Transtorno de conduta antes dos 15, n (%) 46 (19,1) 54 (23,2) 6 (10,5) 0,091 50 (20,5) 49 (20,7) 7 (15,2) 0,694
Personalidade antissocial, n (%) 17 (7,1) 17 (7,3) 1 (1,8) 0,296 16 (6,5) 16 (6,8) 3 (6,5) 0,991
Transtorno depressivo maior, n (%) 91 (37,4) 94 (40,0) 20 (35,1) 0,737 90 (36,1) 92 (38,3) 23 (50,0) 0,207
Dependência de álcool, n (%) 20 (8,2) 17 (7,2) 5 (8,8) 0,887 20 (8,0) 20 (8,3) 2 (4,3) 0,648
Abuso de álcool (lifetime), n (%) 12 (4,9) 16 (6,8) 4 (7,0) 0,643 16 (6,4) 14 (5,8) 2 (4,4) 0,867
Uso de nicotina, n (%) 103 (42,4) 111 (47,2) 20 (35,1) 0,214 99 (39,8) 114 (47,5) 21 (45,7) 0,218
TUS, n (%) 113 (46,5) 118 (50,4) 24 (42,1) 0,460 113 (45,4) 123 (51,3) 19 (42,2) 0,318
Gravidade dos sintomas de TDAH
SNAP desatenção, média (±DP) 1,86 (0,56) 1,91 (0,55) 1,80 (0,51) 0,342 1,90 (0,57) 1,85 (0,54) 1,85 (0,51) 0,642
SNAP hiperatividade, média (±DP) 1,45 (0,76) 1,48 (0,80) 1,32 (0,78) 0,398 1,47 (0,77) 1,39 (0,80) 1,61 (0,76) 0,195
SNAP impulsividade, média (±DP) 1,53 (0,87) 1,59 (0,88) 1,43 (0,89) 0,451 1,60 (0,85) 1,47 (0,90) 1,67 (0,84) 0,180
SNAP TOD, média (±DP) 0,90 (0,57) 0,99 (0,62) 0,74 (0,47) 0,012b 0,93 (0,57) 0,90 (0,58) 1,06 (0,66) 0,248
SNAP TDAH, média (±DP) 1,67 (0,53) 1,71 (0,52) 1,58 (0,52) 0,213 1,71 (0,52) 1,63 (0,53) 1,74 (0,52) 0,251
SNAP TDAH + TOD, média (±DP) 1,43 (0,49) 1,49 (0,50) 1,32 (0,46) 0,056 1,47 (0,48) 1,41 (0,49) 1,53 (0,52) 0,219
Dimensões de temperamento
Procura por novidades, média (±DP) 24,9 (6,12) 24,3 (6,81) 23,7 (5,65) 0,377 24,7 (6,28) 24,1 (6,48) 25,7 (6,45) 0,283
Evitação de danos, média (±DP) 20,5 (7,17) 20,2 (6,95) 21,7 (8,14) 0,367 20,5 (6,96) 20,5 (7,21) 20,3 (8,36) 0,959
Dependência de recompensa, média (±DP) 14,9 (3,86) 14,4 (4,17) 14,7 (4,52) 0,402 14,4 (4,20) 14,9 (3,93) 14,7 (4,03) 0,331
Persistência, média (±DP) 4,1 (1,98) 4,3 (1,82) 4,2 (1,96) 0,477 4,1 (1,87) 4,2 (1,97) 4,40 (1,84) 0,677
Desempenho cognitivo
Escore no subteste vocabulário, média (±DP) 105 (10,2) 105 (10,0) 107 (10,0) 0,590 106 (9,0) 105 (11,0) 107 (9,9) 0,472
Escore no subteste cubos, média (±DP) 99 (12,4) 98 (14,2) 98 (12,4) 0,766 99 (13,1) 97 (12,8) 101 (14,6) 0,216
QI total estimado, média (±DP) 102 (8,5) 102 (10,0) 103 (9,1) 0,723 103 (8,2) 101 (9,5) 104 (10,9) 0,162
Abreviações: TDAH, Transtorno de déficit de atenção e hiperatividade; TOD, transtorno opositor desafiante; TUS, transtorno por uso de substâncias (inclui
abuso e dependência de álcool, uso de nicotina e uso de outras drogas); SNAP, Swanson, Nolan and Pelham Rating Scale; DP, desvio padrão; QI,
Quociente de Inteligência.
Post-hoc (Bonferroni): a AA-AG p=0,30; AG-GG p=0,017; AA-GG p=0,228. b AA-AG p=0,337; AG-GG p=0,012; AA-GG p=0,169.
30
A tabela 6 apresenta a descrição geral dessa amostra de crianças, categorizada de
acordo com os genótipos do polimorfismo rs1799990-PRNP. Da mesma forma que o
observado para adultos, nenhuma associação significativa com esse polimorfismo foi
detectada.
Tabela 6: Efeitos do polimorfismo rs1799990-PRNP em características clínicas da
amostra de crianças com TDAH
Característica rs1799990
Total AA AG GG p*
QI Estimado, média (±DP) 92,2 (13,6) 92,3 (12,9) 92,6 (14,1) 90,9 (14,1) 0,726
Comorbidades
Diagnóstico de TOD, n (%) 159 (37,1) 74 (39,2) 64 (35,6) 21 (35,6) 0,747
Diagnóstico de TC, n (%) 53 (12,4) 22 (11,6) 22 (12,2) 9 (15,3) 0,760
Transtorno de Ansiedade, n (%) 144 (28,6) 65 (30,2) 59 (27,7) 20 (26,3 0,756
Transtorno de Humor, n (%) 56 (11,1) 23 (10,6) 21 (9,9) 12 15,8) 0,355
Gravidade
SNAP Hiperatividade, média (±DP) 1,63 (0,78) 1,67 (0,81) 1,64 (0,74) 1,43 (0,84) 0,342
SNAP Desatenção, média (±DP) 1,92 (0,58) 1,97 (0,59) 1,90 (0,56) 1,85 (0,60) 0,522
SNAP Total, média (±DP) 1,59 (0,56) 1,62 (0,59) 1,59 (0,55) 1,45 (0,53) 0,386
SNAP Oposição, média (±DP) 1,16 (0,78) 1,17 (0,81) 1,17 (0,78) 1,04 (0,63) 0,694
Abreviações: TDAH, Transtorno de déficit de atenção e hiperatividade; QI, Quociente de
Inteligência; TOD, transtorno opositor; TC, transtorno de conduta; SNAP, Swanson, Nolan and Pelham
Rating Scale; DP, desvio padrão.
Na tabela 7 são descritos os testes de associação entre os polimorfismos
investigados na amostra de dependentes de álcool. Não foram detectadas associações
significativas para nenhuma das variáveis clínicas investigadas, para nenhum dos
polimorfismos.
31
Tabela 7: Efeitos dos polimorfismos rs1799990 e rs965560 em características clínicas da amostra de homens dependentes
de álcool
Característica rs1799990- PRNP rs965560-NCAM1
Comorbidades AA AG GG p* GG AG AA p*
Personalidade antissocial 10 (18,5) 6 (10,2) 4 (22,2) 0,335 12 (16,0) 8 (18,2) 0 (0,0) 0,319
Uso de nicotina, n (%) 49 (94,2) 47 (83,9) 15 (88,32) 0,236 64 (88,9) 39 (88,6) 9 (90,0) 0,992
Uso de Drogas, n (%) 9 (17,3) 14 (24,6) 3 (17,6) 0,614 18 (24,7) 7 (15,9) 1 (10,0) 0,364
Depressão, n (%) 17 (32,7) 20 (35,7) 7 (41,2) 0,814 23 (31,9) 15 (34,1) 6 (60,0) 0,235
Alucinações, n (%) 26 (50,0) 38 (66,87) 5 (29,4) 0,016 39 (53,4) 25 (56,8) 5 (50,0) 0,901
Tremores, n (%) 11 (21,2) 17 (29,8) 2 (11,8) 0,238 17 (23,3) 13 (29,5) 0 (0,0) 0,139
Pensamento suicida, n (%) 22 (42,3) 19 (33,3) 6 (35,2) 0,616 25 (34,2) 20 (45,5) 2 (20,0) 0,243
Dimensões de temperamento
Procura por novidades, média (±DP) 15,1 (4,9) 15,9 (5,2) 14,5 (5,0) 0,507 15,7 (5,3) 15,3 (4,9) 14,0 (3,7) 0,571
Evitação de danos, média (±DP) 16,4 (5,2) 17,3 (5,6) 17,7 (4,2) 0,572 16,8 (5,3) 17,8 (5,2) 15,1 (4,5) 0,308
Dependência de recompensa, média (±DP) 16,3 (3,3) 17,2 (3,5) 18,2 (2,5) 0,098 16,9 (3,4) 17,0 (3,1) 16,8 (3,7) 0,974
32
6 DISCUSSÃO
O polimorfismo rs1799990 do gene da Prion protein (PRNP) é um conhecido fator
de risco para formas familiares e esporádicas de doenças priônicas (Prusener, 1998;
Tranchant et al, 1999), dentre elas, podemos destacar, a doença de Creutzfeldt-Jacob
(Palmer et al, 1991) e a insônia familiar fatal (Zerr et al, 1998). Ainda, esse polimorfismo
tem sido associado com a doença de Alzheimer (Dermaut, 2003), com a esclerose
múltipla (Chubukova et al, 2009), com a redução da substância branca em cérebros de
pacientes com esquizofrenia (Rujescu et al, 2002) e com funções cognitivas de pacientes
saudáveis (Rujescu et al, 2003). O envolvimento da proteína PrPc em funções cognitivas
também foi observado em experimentos com camundongos que não expressavam essa
proteína, os quais apresentaram graves deficiências cognitivas. Com a reconstituição da
PrPc nos neurônios, os déficits eram normalizados (Criado et al, 2005). Além disso,
manipulações genéticas no gene PRNP parecem modular os efeitos do álcool em
camundongos (Petit-Paitel et al, 2012, Rial et al, 2013).
Com base nas evidências do envolvimento da PrPc em funções cognitivas, e
também de uma possível influência do gene PRNP na dependência de substâncias,
observada em modelos animais, investigamos um possível papel do polimorfismo
rs1799990 no TDAH e nas dependências de álcool e nicotina. Nossos resultados não
evidenciaram nenhum efeito direto dessa variante na susceptibilidade ao TDAH em
adultos ou aos TUS, álcool e nicotina. Na amostra de crianças, detectamos uma
associação do alelo A com o TDAH. Embora o tamanho amostral do nosso grupo controle
para a infância (n=77) seja bastante pequeno e, portanto, a interpretação desse resultado
requer cautela e mais investigações, em amostras maiores, alguns autores têm
demonstrado que esse alelo está associado com um pior desempenho cognitivo, tanto em
pacientes saudáveis (Rejescu et al, 2003) quanto em pacientes com transtornos
psicóticos (Martorell et al, 2007). Em nossa amostra, no entanto, não detectamos
nenhuma associação do polimorfismo com os escores de QI estimado, tanto em crianças
quanto adultos com TDAH. Cabe ainda ressaltar que, na literatura, o efeito desse
polimorfismo em variáveis cognitivas ainda é bastante controverso, assim como o efeito
de cada alelo em específico. No estudo publicado por Papassotiropaulos et al (2005), os
33
indivíduos portadores do alelo A apresentaram uma melhor memória de longa duração.
Nesse sentido, podemos hipotetizar que a variante rs1799990 no gene PRPN
esteja ligada a situações de prejuízos cognitivos mais graves e processos
neurodegenerativos. O TDAH, nesse quadro, poderia ser considerado um transtorno mais
brando do que os outros já relacionados com a PrPc, e, por consequência disso, o
polimorfismo não tenha tido efeito nas variáveis cognitivas avaliadas em nossas amostras.
Em concordância com os nossos achados, no artigo publicado por Choi et al. (2010), os
autores testam a associação entre o rs1799990 e os fenótipos de esclerose múltipla,
prejuízo cognitivo leve, alcoolismo e esquizofrenia, constatando que, na população
Coreana estudada, essa variante não aumenta a suscetibilidade a nenhuma das
condições avaliadas. Outros estudos também não encontram associações desse
polimorfismo com a esquizofrenia (Rejescu et al, 2002; Tsai et al, 2001). No TDAH,
nenhum estudo prévio investigou essa variante.
Como mencionado anteriormente, alterações do gene PRNP podem estar ligadas
aos TUS e, com base nisso, também avaliamos um possível efeito diferencial em crianças
com maior risco de desenvolver TUS, que são as crianças que, além de apresentar
TDAH, apresentam simultaneamente o TC. No entanto, ao compararmos o grupo de
crianças com TDAH e TC com crianças que apresentam apenas TDAH, não detectamos
diferenças genéticas significativas entre os grupos.
Outra hipótese testada foi a da desinibição comportamental, que tenta explicar uma
maior propensão de desenvolver TUS em indivíduos com TDAH. De acordo com essa
hipótese, o TDAH e os TUS, juntamente com os transtornos disruptivos do
comportamento, como o TC e o TOD, fariam parte de um espectro de comportamentos e
patologias que compartilham uma via de susceptibilidade, que reflete numa tendência à
desinibição comportamental. Desta forma, esses indivíduos apresentariam um padrão de
comportamento e de temperamento que os levaria a buscar uma gratificação imediata,
não se preocupando com as ações serem socialmente inadequadas ou apresentarem
consequências negativas a médio e longo prazo, o que os levaria também a maiores
chances de uso de substâncias. Para avaliar esse aspecto, investigamos o papel do
polimorfismo no gene PRNP nas dimensões de temperamento e também nos transtornos
disruptivos de comportamento. Nossos resultados não demonstram nenhum efeito do
polimorfismo nas variáveis de temperamento, nas amostras de pacientes adultos com
34
TDAH e de homens dependentes de álcool. No entanto, detectamos uma associação do
genótipo AG do polimorfismo com a presença de TOD e com escores de gravidade dos
sintomas de TOD mais elevados, em comparação com o genótipo GG, em adultos com
TDAH. Esses achados, juntamente com a associação do alelo A com o TDAH na infância,
apontam para um possível efeito dessa variante no TDAH. No entanto, esses achados
ainda precisam ser melhores explorados e caracterizados.
O gene NCAM1, por sua vez, já foi associado com déficits neurocognitivos através
de prejuízos na plasticidade ou conectividade neuronal (Sullivan et al, 2007). Também já
foi relacionado com a esquizofrenia e o transtorno do humor bipolar (Arai et al. 2004;
Lewis et al, 2003; Sullivan et al, 2007; Atz at al, 2007). O estudo de Schmitt-Ulms et al.
(2001) mostrou que existe uma interação entre o gene PRNP e o gene NCAM1, mas não
conseguiu identificar sobre quais funções celulares essa interação age. Já o estudo
publicado por Santuccione et al (2005) mostra que essa interação entre os dois genes
existe e está envolvida com o desenvolvimento do SNC. Em nosso estudo, testamos a
interação entre o polimorfismo rs1799990, no gene PRNP, e o polimorfismo rs965560, no
gene NCAM1 e os resultados indicaram que a interação testada não apresenta um papel
significativo na susceptibilidade ao TDAH ou às dependências de álcool e nicotina. Da
mesma forma, o polimorfismo investigado no gene NCAM1 não apresentou efeitos
principais em nenhuma das variáveis investigadas, tanto na amostra de adultos com
TDAH, quanto nas amostras de dependentes de álcool e nicotina.
7 CONCLUSÃO
Em conjunto, nossos resultados indicam que o polimorfismo rs1799990, no gene
PRNP, pode estar associado com o TDAH na infância e com a presença de TOD em
adultos com TDAH. Para as dependências de álcool e nicotina, nenhum efeito significativo
dessa variante foi detectado. Não foram detectadas interações significativa entre os
polimorfismos sobre a suscetibilidade ao TDAH, e as dependências de álcool e nicotina.
Esses resultados, no entanto, são preliminares e não foram testados para múltiplos testes.
Novas análises mais aprofundadas são necessárias para avaliar o real impacto dessa
variante no TDAH.
35
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