Separação de proteínas da clara do ovo de galinha por membranas filtrantes e análise do seu potencial antimicrobiano
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Data
2023-10
Autores
Orientador
Stülp, Simone
Banca
Konrad, Odorico
Heidrich, Daiane
Lara, Daniela Mueller De
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ISSN
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Editor
Resumo
As mudanças nas formas de produção têm ganhado destaque devido à crescente integração de produtos naturais nos processos industriais. Essas mudanças têm sido impulsionadas, principalmente, pela mudança de atitude dos consumidores em relação ao meio ambiente, à sustentabilidade e à segurança alimentar. Nesse contexto, os agentes antimicrobianos são uma alternativa e agem preservando os alimentos, limitando o crescimento dos microrganismos patogênicos. Dentre eles, as proteínas ou concentrados protéicos, provenientes da clara do ovo de galinha ocupam lugar de destaque, pois além de ser excelente fonte de proteínas a clara do ovo também contém um arsenal de moléculas antimicrobianas. Assim, este estudo teve como objetivo central a concentração de proteínas com potencial antimicrobiano presentes na clara do ovo de galinha, com posterior avaliação da eficácia antimicrobiana dessas proteínas frente a microrganismos patogênicos comuns na indústria alimentícia. Para atingir esse objetivo, realizou-se a concentração das proteínas da clara de ovo, tanto da forma pasteurizada quanto in natura. Utilizamos uma série de etapas de ultrafiltração, empregando membranas orgânicas de polietersulfona com diferentes tamanhos de poros (200 kDa, 50 kDa e 20 kDa) em uma planta piloto de bancada. Inicialmente foram testadas condições para determinação dos parâmetros ótimos de operação do sistema (pressão, velocidade de agitação e solução de alimentação). Os ensaios ocorreram em temperatura ambiente e as alíquotas das proteínas de interesse (avidina, ovotransferrina e lisozima) foram coletadas nos ciclos intermediário e final dos processos de ultrafiltração (UF). Com os parâmetros de operação definidos pressão de 5 bar, 15 rpm de velocidade de agitação, e solução de clara de ovo in natura, as amostras foram dessalinizadas utilizando tecnologia de diálise com membrana semipermeável e secas por meio da técnica de liofilização. Análise cromatográfica em condição de fase reversa foi realizada para identificação e quantificação dos concentrados proteicos. A atividade antimicrobiana foi realizada utilizando a metodologia de microdiluição em placa de 96 poços, adaptada de Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012) frente a microrganismos patógenos de interesse da indústria de alimentos como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus cereus isolado ambiental, Escherichia coli, Salmonella enteritidis. A etapa de dessalinização ocorreu ao longo das etapas de UF. Pode-se observar que a concentração de íons sódio foram reduzidas nas correntes de interesse retentado (50 kDa) e permeado (20 kDA) na ordem de 96,25% e 98,01%, respectivamente. Com a dessalinização essa concentração foi reduzida para 8 mg/L. Os picos cromatográficos foram identificados em tempos de retenção de 11,99 min e 11,09 min para etapas intermediária e final, respectivamente. Através da medição das áreas dos picos formados, foi possível calcular a concentração das proteínas de interesse. No último estágio de filtração, a lisozima foi concentrada a 9,83 mg/L, enquanto nas etapas intermediárias, as concentrações de lisozima (LZ) e ovotransferrina (OVT) atingiram 35,99 mg LZ/L e 95,50 mg OVT/L, respectivamente. As amostras então foram testadas em microrganismos da indústria láctea e cárnea e pode-se observar que não houveram diferenças significativas entre as amostras avaliadas. Entretanto, quando comparada a amostra da retentada e o padrão comercial LZ, observou-se diferença significativa, especialmente para B. cereus e E.coli. Logo o resultado acima obtido foi adequado para o objetivo proposto.
Changes in production methods have gained prominence due to the increasing integration of natural products into industrial processes. These changes have been driven mainly by changing consumer attitudes towards the environment, sustainability and food safety. In this context, antimicrobial agents are an alternative and act to preserve food by limiting the growth of pathogenic microorganisms. Among them, proteins or protein concentrates derived from hen's egg white occupy a prominent place because, besides being an excellent source of proteins, egg white also contains an arsenal of antimicrobial molecules. Therefore, the main objective of this study was to concentrate proteins with antimicrobial potential present in hen egg white and then evaluate their antimicrobial efficacy against pathogenic microorganisms commonly found in the food industry. To achieve this goal, we concentrated the proteins present in both pasteurized and natural egg white. We used a series of ultrafiltration steps using organic polyethersulfone membranes with different pore sizes (200 kDa, 50 kDa and 20 kDa) in a bench-top pilot plant. Initially, conditions were tested to determine the optimal operating parameters of the system (pressure, stirring speed and feed solution). The tests were performed at room temperature and aliquots of the proteins of interest (avidin, ovotransferrin and lysozyme) were collected in the intermediate and final cycles of the ultrafiltration (UF) processes. The samples were desalted using semi-permeable membrane dialysis technology and dried using lyophilization technology, with operating parameters set at 5 bar pressure, 15 rpm stirring speed and fresh egg white solution.Reverse-phase chromatographic analysis was performed to identify and quantify the protein concentrates. Antimicrobial activity was performed using the 96-well plate microdilution method adapted from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012) against pathogenic microorganisms of interest to the food industry, such as Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus cereus environmental isolate, Escherichia coli, Salmonella enteritidis. The demineralization stage took place in parallel with the UF stages. It can be seen that the concentration of sodium ions in the retentate (50 kDa) and permeate (20 kDA) streams of interest was reduced by 96.25% and 98.01%, respectively. Desalting reduced this concentration to 8 mg/L. The chromatographic peaks were identified with retention times of 11.99 min and 11.09 min for the intermediate and final stages, respectively. By measuring the areas of the peaks formed, the concentration of the proteins of interest could be calculated. In the last filtration step, lysozyme was concentrated to 9.83 mg/L, while in the intermediate steps, the concentrations of lysozyme (LZ) and ovotransferrin (OVT) reached 35.99 mg LZ/L and 95.50 mg OVT/L, respectively. The samples were then tested for microorganisms from the dairy and meat industries and it can be seen that there were no significant differences between the samples tested. However, when comparing the retentate sample with the commercial standard LZ, a significant difference was observed, especially for B. cereus and E. coli. Therefore, the result obtained above was sufficient for the proposed objective.
Los cambios en los métodos de producción han cobrado protagonismo debido a la creciente integración de los productos naturales en los procesos industriales. Estos cambios se han visto impulsados principalmente por la evolución de la actitud de los consumidores hacia el medio ambiente, la sostenibilidad y la seguridad alimentaria. En este contexto, los agentes antimicrobianos son una alternativa y actúan para conservar los alimentos limitando el crecimiento de microorganismos patógenos. Entre ellos, las proteínas o concentrados proteicos de la clara de huevo de gallina ocupan un lugar destacado, ya que además de ser una excelente fuente de proteínas, la clara de huevo también contiene un arsenal de moléculas antimicrobianas. Por lo tanto, el principal objetivo de este estudio era concentrar las proteínas con potencial antimicrobiano presentes en la clara de huevo de gallina y, a continuación, evaluar la eficacia antimicrobiana de estas proteínas frente a microorganismos patógenos comunes en la industria alimentaria. Para alcanzar este objetivo, se concentraron las proteínas de la clara de huevo, tanto en forma pasteurizada como in natura. Utilizamos una serie de pasos de ultrafiltración, empleando membranas orgánicas de polietersulfona con diferentes tamaños de poro (200 kDa, 50 kDa y 20 kDa) en una planta piloto de sobremesa. Inicialmente, se probaron las condiciones para determinar los parámetros de funcionamiento óptimos del sistema (presión, velocidad de agitación y solución de alimentación). Las pruebas se realizaron a temperatura ambiente y se recogieron alícuotas de las proteínas de interés (avidina, ovotransferrina y lisozima) en los ciclos intermedio y final de los procesos de ultrafiltración (UF). Con los parámetros operativos fijados en 5 bares de presión, 15 rpm de velocidad de agitación y solución de clara de huevo fresca, las muestras se desalaron mediante la tecnología de diálisis con membrana semipermeable y se secaron mediante la técnica de liofilización. Se realizaron análisis cromatográficos en fase inversa para identificar y cuantificar los concentrados de proteínas. La actividad antimicrobiana se llevó a cabo mediante la metodología de microdilución en placa de 96 pocillos, adaptada del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012) frente a microorganismos patógenos de interés para la industria alimentaria como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus cereus aislado ambiental, Escherichia coli, Salmonella enteritidis. La etapa de desalinización tuvo lugar junto con las etapas de UF. Puede observarse que la concentración de iones de sodio se redujo en las corrientes de interés de retentado (50 kDa) y permeado (20 kDA) en un 96,25% y un 98,01% respectivamente. Con la desalinización, esta concentración se redujo a 8 mg/L. Los picos cromatográficos se identificaron a tiempos de retención de 11,99 min y 11,09 min para las etapas intermedia y final, respectivamente. Midiendo las áreas de los picos formados, fue posible calcular la concentración de las proteínas de interés. En la última etapa de filtración, la lisozima se concentró a 9,83 mg/L, mientras que en las etapas intermedias, las concentraciones de lisozima (LZ) y ovotransferrina (OVT) alcanzaron 35,99 mg LZ/L y 95,50 mg OVT/L, respectivamente. A continuación, las muestras se sometieron a pruebas con microorganismos de las industrias láctea y cárnica y se observó que no había diferencias significativas entre las muestras evaluadas. Sin embargo, al comparar la muestra retenida y el estándar comercial LZ, se observaron diferencias significativas, especialmente para B. cereus y E.coli. Por lo tanto, el resultado obtenido anteriormente era adecuado para el objetivo propuesto.
Changes in production methods have gained prominence due to the increasing integration of natural products into industrial processes. These changes have been driven mainly by changing consumer attitudes towards the environment, sustainability and food safety. In this context, antimicrobial agents are an alternative and act to preserve food by limiting the growth of pathogenic microorganisms. Among them, proteins or protein concentrates derived from hen's egg white occupy a prominent place because, besides being an excellent source of proteins, egg white also contains an arsenal of antimicrobial molecules. Therefore, the main objective of this study was to concentrate proteins with antimicrobial potential present in hen egg white and then evaluate their antimicrobial efficacy against pathogenic microorganisms commonly found in the food industry. To achieve this goal, we concentrated the proteins present in both pasteurized and natural egg white. We used a series of ultrafiltration steps using organic polyethersulfone membranes with different pore sizes (200 kDa, 50 kDa and 20 kDa) in a bench-top pilot plant. Initially, conditions were tested to determine the optimal operating parameters of the system (pressure, stirring speed and feed solution). The tests were performed at room temperature and aliquots of the proteins of interest (avidin, ovotransferrin and lysozyme) were collected in the intermediate and final cycles of the ultrafiltration (UF) processes. The samples were desalted using semi-permeable membrane dialysis technology and dried using lyophilization technology, with operating parameters set at 5 bar pressure, 15 rpm stirring speed and fresh egg white solution.Reverse-phase chromatographic analysis was performed to identify and quantify the protein concentrates. Antimicrobial activity was performed using the 96-well plate microdilution method adapted from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012) against pathogenic microorganisms of interest to the food industry, such as Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus cereus environmental isolate, Escherichia coli, Salmonella enteritidis. The demineralization stage took place in parallel with the UF stages. It can be seen that the concentration of sodium ions in the retentate (50 kDa) and permeate (20 kDA) streams of interest was reduced by 96.25% and 98.01%, respectively. Desalting reduced this concentration to 8 mg/L. The chromatographic peaks were identified with retention times of 11.99 min and 11.09 min for the intermediate and final stages, respectively. By measuring the areas of the peaks formed, the concentration of the proteins of interest could be calculated. In the last filtration step, lysozyme was concentrated to 9.83 mg/L, while in the intermediate steps, the concentrations of lysozyme (LZ) and ovotransferrin (OVT) reached 35.99 mg LZ/L and 95.50 mg OVT/L, respectively. The samples were then tested for microorganisms from the dairy and meat industries and it can be seen that there were no significant differences between the samples tested. However, when comparing the retentate sample with the commercial standard LZ, a significant difference was observed, especially for B. cereus and E. coli. Therefore, the result obtained above was sufficient for the proposed objective.
Los cambios en los métodos de producción han cobrado protagonismo debido a la creciente integración de los productos naturales en los procesos industriales. Estos cambios se han visto impulsados principalmente por la evolución de la actitud de los consumidores hacia el medio ambiente, la sostenibilidad y la seguridad alimentaria. En este contexto, los agentes antimicrobianos son una alternativa y actúan para conservar los alimentos limitando el crecimiento de microorganismos patógenos. Entre ellos, las proteínas o concentrados proteicos de la clara de huevo de gallina ocupan un lugar destacado, ya que además de ser una excelente fuente de proteínas, la clara de huevo también contiene un arsenal de moléculas antimicrobianas. Por lo tanto, el principal objetivo de este estudio era concentrar las proteínas con potencial antimicrobiano presentes en la clara de huevo de gallina y, a continuación, evaluar la eficacia antimicrobiana de estas proteínas frente a microorganismos patógenos comunes en la industria alimentaria. Para alcanzar este objetivo, se concentraron las proteínas de la clara de huevo, tanto en forma pasteurizada como in natura. Utilizamos una serie de pasos de ultrafiltración, empleando membranas orgánicas de polietersulfona con diferentes tamaños de poro (200 kDa, 50 kDa y 20 kDa) en una planta piloto de sobremesa. Inicialmente, se probaron las condiciones para determinar los parámetros de funcionamiento óptimos del sistema (presión, velocidad de agitación y solución de alimentación). Las pruebas se realizaron a temperatura ambiente y se recogieron alícuotas de las proteínas de interés (avidina, ovotransferrina y lisozima) en los ciclos intermedio y final de los procesos de ultrafiltración (UF). Con los parámetros operativos fijados en 5 bares de presión, 15 rpm de velocidad de agitación y solución de clara de huevo fresca, las muestras se desalaron mediante la tecnología de diálisis con membrana semipermeable y se secaron mediante la técnica de liofilización. Se realizaron análisis cromatográficos en fase inversa para identificar y cuantificar los concentrados de proteínas. La actividad antimicrobiana se llevó a cabo mediante la metodología de microdilución en placa de 96 pocillos, adaptada del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012) frente a microorganismos patógenos de interés para la industria alimentaria como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus cereus aislado ambiental, Escherichia coli, Salmonella enteritidis. La etapa de desalinización tuvo lugar junto con las etapas de UF. Puede observarse que la concentración de iones de sodio se redujo en las corrientes de interés de retentado (50 kDa) y permeado (20 kDA) en un 96,25% y un 98,01% respectivamente. Con la desalinización, esta concentración se redujo a 8 mg/L. Los picos cromatográficos se identificaron a tiempos de retención de 11,99 min y 11,09 min para las etapas intermedia y final, respectivamente. Midiendo las áreas de los picos formados, fue posible calcular la concentración de las proteínas de interés. En la última etapa de filtración, la lisozima se concentró a 9,83 mg/L, mientras que en las etapas intermedias, las concentraciones de lisozima (LZ) y ovotransferrina (OVT) alcanzaron 35,99 mg LZ/L y 95,50 mg OVT/L, respectivamente. A continuación, las muestras se sometieron a pruebas con microorganismos de las industrias láctea y cárnica y se observó que no había diferencias significativas entre las muestras evaluadas. Sin embargo, al comparar la muestra retenida y el estándar comercial LZ, se observaron diferencias significativas, especialmente para B. cereus y E.coli. Por lo tanto, el resultado obtenido anteriormente era adecuado para el objetivo propuesto.
Descrição
Palavras-chave
Indústria Alimentícia; Conservantes Naturais; Food Industry; Natural Preservative; Industria Alimentaria; Conservante Natural
Citação
OBERHERR, Renata. SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS DA CLARA DO OVO DE GALINHA POR MEMBRANAS FILTRANTES E ANÁLISE DO SEU POTENCIAL ANTIMICROBIANO. 2023. Tese (Doutorado) – Curso de Ambiente e Desenvolvimento, Universidade do Vale do Taquari - Univates, Lajeado, 25 ago. 2023. Disponível em: http://hdl.handle.net/10737/3934.