Reutilizar os grãos de kefir por muito tempo pode mudar o sabor e a saúde da bebida, aponta estudo brasileiro

Este texto contém um glossário que explica os termos técnicos empregados na reportagem, mantidos ao longo da notícia para fortalecer sua precisão conceitual

Um estudo conduzido por pesquisadores da Universidade do Vale do Taquari - Univates e da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (Ufrgs) revelou que a prática milenar de reutilizar os grãos de kefir em sucessivos ciclos de fermentação, o chamado "back-slopping”, não é uma operação neutra do ponto de vista biológico.

Segundo os resultados, publicados na revista científica International Dairy Journal, o uso contínuo dos mesmos grãos ao longo de 100, 150 e 200 ciclos de fermentação provoca uma redução progressiva na diversidade de bactérias e leveduras que compõem esses grãos, com consequências diretas sobre o sabor, o valor nutricional e a aceitação do produto pelos consumidores.

A pesquisa, intitulada "Successive reuse of kefir grains shapes microbial communities and fermentation profiles" ("A reutilização sucessiva de grãos de kefir molda comunidades microbianas e perfis de fermentação", em tradução livre), foi assinada por Gabriela Rabaioli Rama, Jeferson Ströher, Lilian de Fátima Ferreira da Silva, Laís Bresciani, Marisa Demarco, Marcela Mendes Salazar, Daniel Neutzling Lehn e Camille Eichelberger Granada, esta última responsável pela correspondência científica do artigo. 

O trabalho integra o Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Univates, em parceria com o Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos da Ufrgs, em Porto Alegre, e contou com apoio do Parque Científico e Tecnológico do Vale do Taquari - Tecnovates e da empresa Fermenta Biotecnologia.

Um alimento milenar sob nova lente científica

O kefir é uma bebida láctea fermentada tradicional, produzida a partir de "grãos", pequenas estruturas gelatinosas formadas por uma matriz de polissacarídeos e proteínas que abrigam um consórcio complexo de bactérias ácido-lácticas, bactérias acéticas e leveduras, que transformam os componentes do leite em ácidos orgânicos, gás carbônico, etanol e compostos voláteis responsáveis pelo sabor e aroma característicos do produto.

Por funcionarem como culturas iniciadoras "indefinidas" e autopropagáveis, os grãos de kefir são reutilizados indefinidamente pelos produtores: ao final de cada fermentação, são retirados do leite fermentado, lavados e transferidos para um novo lote de leite fresco, repetindo o ciclo. Essa característica torna o kefir um modelo interessante para o estudo da dinâmica de comunidades microbianas e da estabilidade de ecossistemas em sistemas alimentares, mas também levanta uma pergunta pouco explorada até então: o que acontece com esses microrganismos depois de centenas de reutilizações?

Segundo os autores, estudos anteriores já haviam mapeado a composição microbiana do kefir, mas a maioria acompanhou linhagens de grãos por períodos de propagação relativamente curtos. Uma avaliação sistemática ao longo de um histórico de reuso tão extenso quanto o analisado nesta pesquisa, até 200 ciclos de fermentação, ainda não havia sido realizada.

Como o estudo foi conduzido

Os grãos utilizados na pesquisa foram recebidos liofilizados em 2019 e usados para produção artesanal de kefir até 2020, quando passaram a ser armazenados congelados. Em 2023 foram reativados por meio de 15 ciclos diários sucessivos de fermentação e, a partir daí, mantidos como uma única linhagem, propagados em ciclos de 24 horas em leite UHT integral, sempre na proporção de 5% de grãos para o total de leite utilizado.

A cada ciclo, o excesso de biomassa gerado pelo crescimento dos grãos era removido, e os grãos eram lavados e transferidos para leite fresco, em condições similares às de uma produção artesanal, ou seja, sem esterilização total, apenas com superfícies e utensílios sanitizados.

Para avaliar os efeitos do uso prolongado, os pesquisadores coletaram amostras de biomassa dos grãos em três momentos específicos: após 100, 150 e 200 ciclos sequenciais de fermentação, nomeados respectivamente de K1, K2 e K3. É importante destacar que esses números se referem apenas aos ciclos realizados em laboratório, sob condições documentadas, após a reativação dos grãos em 2023 -- o histórico de uso comercial entre 2019 e 2020 não pôde ser precisamente contabilizado.

A partir de cada um desses três "estados" do grão, os cientistas realizaram fermentações experimentais controladas, em triplicata, incubando 100 gramas de grãos em 2 litros de leite UHT a 25°C. Amostras da bebida foram coletadas em quatro momentos, 0, 12, 24 e 48 horas de fermentação (as últimas 24 horas correspondendo a uma fase de maturação sem os grãos, seguindo o protocolo do produtor comercial que doou o material), além de amostras dos próprios grãos após 24 horas.

Todo esse material passou por uma bateria de análises: sequenciamento genético de última geração (amplicon sequencing das regiões 16S rRNA, para bactérias, e ITS, para fungos), quantificação de açúcares e ácidos orgânicos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), dosagem de vitaminas, análise de compostos voláteis por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas e uma avaliação sensorial com 64 consumidores voluntários, aprovada pelo Comitê Nacional de Ética em Pesquisa (Conep).

Menos diversidade, mais ácido acético

Os resultados mostram um padrão consistente: quanto mais os grãos foram reutilizados, menor a diversidade de microrganismos neles presentes. No total foram identificadas 255 variantes de sequência de amplicon (ASVs) bacterianas em todas as amostras. Nos grãos, a riqueza, ou seja, o número de diferentes tipos de bactérias detectadas, caiu de 92 e 93 ASVs em K1 e K2, respectivamente, para apenas 65 em K3. Na bebida fermentada, o padrão se repetiu: K3 apresentou apenas 78 ASVs, contra 197 em K1 e 237 em K2.

O mesmo aconteceu com os fungos: comunidades heterogêneas em K1 e K2 deram lugar, em K3, a uma dominância quase absoluta de leveduras da família Saccharomycetaceae. Já entre as bactérias, todos os grupos permaneceram dominados por membros da ordem Lactobacillales, que reúne as chamadas bactérias ácido-lácticas, mas com perda progressiva de outros gêneros que conviviam com elas nos estágios iniciais, como Streptococcus, presente de forma significativa em K2.

A simplificação microbiológica veio acompanhada de mudanças metabólicas. Nos grãos com 200 ciclos (K3), a concentração de ácido cítrico foi cerca de três vezes menor do que nos grãos K1 e K2, enquanto a concentração de ácido acético foi maior. O mesmo padrão apareceu na bebida fermentada ao longo de todo o processo. Segundo os pesquisadores, esse conjunto de achados indica uma mudança no equilíbrio metabólico dos grãos, com produção aumentada de acetato e alteração no aproveitamento do citrato, um sinal de que o metabolismo se tornou mais heterofermentativo, isto é, passou a gerar mais subprodutos além do ácido láctico, como o próprio ácido acético, etanol e gás carbônico.

Também houve diferenças na quantidade de lactose residual: após 48 horas de fermentação, os grãos K3 mantiveram concentrações maiores de lactose não consumida do que K1 e K2, sugerindo menor eficiência na fermentação do açúcar do leite conforme o número de reutilizações aumenta. A produção de ácido láctico, por sua vez, foi maior em K1 depois de 24 horas de fermentação, comparada a K2 e K3, assinalando a ideia de que os grãos mais "jovens" (com menos ciclos de uso) mantêm uma atividade fermentativa mais homofermentativa, focada na produção de ácido láctico.

Análises multivariadas dos compostos voláteis, vitaminas e proteínas também revelaram diferenças relacionadas ao tempo de reuso. Uma análise de componentes principais mostrou separação clara entre K1 e os demais grupos, enquanto K2 e K3 apresentaram sobreposição parcial, indicando que, com o passar do tempo, os perfis metabólicos das diferentes fases foram convergindo.

O paladar também percebe a diferença

Um dos aspectos mais interessantes do estudo é a conexão entre as mudanças microbiológicas e metabólicas e a percepção sensorial dos consumidores. Embora a avaliação sensorial formal não tenha encontrado diferenças estatisticamente significativas entre as três bebidas para nenhum dos atributos avaliados (cor, textura, odor e aceitação global), análises multivariadas mais refinadas apontaram uma tendência clara: o kefir produzido com grãos de reuso intermediário (K2, correspondente a 150 ciclos) foi o mais bem avaliado pelos participantes, enquanto o de reuso mais extenso (K3, 200 ciclos) recebeu as notas mais baixas.

Essa diferença de percepção parece estar diretamente relacionada à composição química das bebidas. K2 esteve associado a uma gama mais ampla de compostos voláteis, como ácido butanoico, ácido hexanoico, nonanona e heptanona, que costumam contribuir para uma complexidade aromática mais agradável em produtos lácteos fermentados. Já K3 esteve associado a concentrações elevadas de ácido acético e menor diversidade microbiana, características frequentemente relacionadas a atributos sensoriais descritos como "ácidos" ou "de vinagre", que tendem a ser menos apreciados pelos consumidores.

De acordo com os pesquisadores, esses padrões sugerem que a perda de diversidade microbiana pode restringir o equilíbrio metabólico da fermentação, deslocando os resultados para perfis dominados por acetato, o que, em excesso, prejudica a experiência sensorial da bebida.

Limites da tecnologia e cuidados na interpretação

Os autores fazem uma ressalva metodológica: uma parte das sequências bacterianas identificadas não pôde ser classificada além do nível de ordem (Lactobacillales). Isso não se deve a uma falha na análise, mas a uma limitação conhecida da técnica de sequenciamento de fragmentos curtos (a região V3-V4 do gene 16S rRNA) para identificar bactérias ácido-lácticas: em 2020, uma reclassificação taxonômica redistribuiu mais de 260 espécies do antigo gênero Lactobacillus em 23 novos gêneros, mas esses grupos, mesmo sendo taxonomicamente distintos, compartilham sequências genéticas quase idênticas nessa região específica do DNA. Isso torna difícil, com a tecnologia usada no estudo, diferenciar com precisão os gêneros e, por consequência, inferir se o metabolismo predominante é homofermentativo ou heterofermentativo apenas a partir dos dados taxonômicos. Os autores indicam que técnicas de metagenômica shotgun, mais completas, poderiam superar essa limitação em pesquisas futuras.

Outro ponto de cautela levantado pelos próprios pesquisadores é que o histórico de propagação dos grãos antes do período de armazenamento durante a pandemia não é conhecido, o que significa que o grupo K1 (100 ciclos) deve ser interpretado como o estágio de reuso mais antigo observado a partir da reativação dos grãos, e não como uma linha de base ecológica absoluta. Por isso, as diferenças observadas devem ser entendidas como comparações relativas entre os estágios de reuso, e não como representações absolutas do que ocorre em condições reais de produção artesanal contínua.

Recomendações práticas para produtores

Apesar das limitações, os pesquisadores sugerem que os achados têm implicações práticas relevantes para produtores artesanais de kefir, que costumam reutilizar os mesmos grãos por longos períodos sem controle rigoroso. Entre as recomendações levantadas no estudo estão: limitar o número total de ciclos consecutivos de reuso antes de renovar o estoque de grãos; manter uma proporção constante entre grãos e leite ao longo da propagação, removendo o excesso de biomassa em vez de deixá-lo acumular; controlar rigorosamente a temperatura e a duração de cada ciclo de fermentação; armazenar alíquotas de reserva dos grãos em temperaturas muito baixas (-80°C) nos estágios iniciais de uso, permitindo reintroduzir comunidades mais diversas caso a qualidade do produto se deteriore com o tempo; e monitorar a concentração de ácido acético ao longo do tempo como um indicador prático e acessível de simplificação da comunidade microbiana.

Os autores ressaltam, contudo, que essas recomendações precisam ser validadas em condições reais de produção artesanal antes de serem adotadas de forma ampla.

Glossário

Amplicon sequencing (sequenciamento de amplicons): técnica de sequenciamento genético que analisa fragmentos específicos do DNA (amplicons) para identificar e comparar microrganismos presentes em uma amostra.

ASV (Amplicon Sequence Variant / Variante de Sequência de Amplicon): unidade usada para identificar, com alta precisão, diferentes sequências genéticas de microrganismos detectadas em uma amostra, funcionando como uma espécie de "impressão digital" microbiana.

Back-slopping: prática tradicional de fermentação em que parte de um lote já fermentado (ou os grãos/cultura usados nele) é reaproveitada para iniciar um novo lote, em vez de usar uma cultura iniciadora nova a cada vez.

Bactérias ácido-lácticas (LAB): grupo de bactérias que fermentam açúcares produzindo principalmente ácido láctico, responsáveis por boa parte da acidificação e conservação de alimentos fermentados como iogurte, kefir e queijos.

Diversidade alfa (alpha diversity): medida que indica a variedade de espécies (riqueza) e o equilíbrio entre elas (uniformidade) dentro de uma única amostra ou comunidade microbiana.

Diversidade beta (beta diversity): medida que compara a diferença na composição microbiana entre duas ou mais amostras ou comunidades diferentes.

Fermentação heterofermentativa: tipo de fermentação em que os microrganismos produzem, além do ácido láctico, outros subprodutos como ácido acético, etanol e gás carbônico.

Fermentação homofermentativa: tipo de fermentação em que os microrganismos produzem predominantemente ácido láctico como produto final, com pouca formação de outros compostos.

HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência): técnica analítica de laboratório usada para separar, identificar e quantificar substâncias químicas presentes em uma amostra, como açúcares e ácidos orgânicos.

Índice de Shannon: fórmula matemática amplamente usada em ecologia e microbiologia para calcular a diversidade de espécies em uma comunidade, considerando tanto o número de espécies quanto sua abundância relativa.

Kefiran: exopolissacarídeo (tipo de açúcar complexo) produzido pelos microrganismos do kefir, responsável pela estrutura gelatinosa característica dos grãos.

Metagenômica shotgun: técnica de sequenciamento genético que analisa todo o material genético presente em uma amostra, permitindo identificação taxonômica e funcional mais detalhada do que o sequenciamento de amplicons.

PCoA (Principal Coordinate Analysis / Análise de Coordenadas Principais): método estatístico usado para visualizar, em um gráfico, o grau de semelhança ou diferença entre comunidades microbianas de diferentes amostras.

SIMPER (Similarity Percentage Analysis): análise estatística que identifica quais espécies ou grupos microbianos mais contribuem para as diferenças observadas entre diferentes amostras ou grupos.

Crédito da imagem da capa da notícia: - Usuário Donald (Wikimedia Commons)